恩度聯合紫杉醇不同給藥時序對肺癌荷瘤小鼠的抗腫瘤效應觀察

吳 芳 陳鳳舞 劉方文 紀 巧 王小慧 郭 妮

目前抗血管內皮生成藥物——恩度，廣泛用于臨床，并取得較好療效。外周血中測得的血管內皮細胞-循環內皮細胞(circulating endothelial cells，0CECs)，可促進腫瘤新生血管的形成且能較好的反應腫瘤患者體內血管生成的狀態，可能是1個與預后密切相關的靈敏檢測指標。許多研究表明，CECs是1個很好的抗血管生成療效指標。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c裸鼠32只,4～5周齡,雌性,體重16～18 g,購自南昌大學醫學院藥物研究所。人肺腺癌A549細胞由南昌大學醫學院藥物研究所惠贈。恩度15 mg/支，先聲藥業惠贈，批號:S20050088。紫杉醇，60 mg/支，黃石李時珍藥業集團惠贈，批號H20058368。美國Beckman-Coulter 公司流式細胞儀(型號:EPICS-XL IIMCL，科大創新公司 KDC-6000R 低速冷凍離心機，分析系統軟件System II)。抗體:大鼠抗裸鼠CD45-PE (CHEMICON公司)。大鼠抗裸鼠CD146-FITC (CHEMICON公司)。同型對照:大鼠FITC-IgG2a(CHEMICON公司)，大鼠IgG2b-PE(CHEMICON公司)，紅細胞裂解液及流式液購自美國Beckmancoutler公司。

1.2 方法

1.2.1 建立人肺腺癌A549細胞系動物模型 制備瘤源鼠動物模型:在RPMI-1640培養液中傳代培養解凍的人肺腺癌細胞系A549，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養，1周后采集細胞，制成濃度約 5×107個/ml的單細胞懸液，接種于裸鼠的雙側鼠蹊部，每側注射 200 μl。制備荷瘤實驗鼠：BALB/c裸鼠32只隨機分成4組,每組8只：同時給藥組，先恩度給藥組，模型組和空白對照組。將制備好的瘤塊接種于裸鼠的鼠蹊部,接種3組,共24只，空白對照組8只不接種瘤塊。

1.2.2 給藥方法 使用注射用水配制恩度注射液，皮下注射；使用生理鹽水配制紫杉醇注射液，腹腔注射。

同時給藥組:恩度，每天300 μg/只，d1～d35，紫杉醇，30 mg/kg/3天，d1～d19，給藥第35天處死。先恩度給藥組:恩度，每天300 μg/只，d1～d35;紫杉醇，30 mg/kg/3天，d16～d34。給藥第35天處死。模型組：生理鹽水，每天100 μl/只，皮下注射，d1、d35；注射用水，300 μl/只/3天，腹腔注射，d1、d35。第35天處死。空白組：給藥同模型組。

1.2.3 采血及處死 給藥完畢后1天，摘眼球取血。隨后以脫頸椎法處死裸鼠。完整剝離瘤組織。

1.2.4 繪制移植瘤生長曲線，計算抑瘤率 每周稱裸鼠體重2次。每周測量加藥后瘤塊的長徑a及短徑b 2次，按公式(瘤體積V=a×b2/2)計算移植瘤體積，計算每組平均值，繪制移植瘤生長曲線。計算抑瘤率=(1-治療組體積/對照組體積 )× 100%。

1.2.5 FCM(流式細胞術)檢測裸鼠血中aCECs水平 ①取2支流式細胞檢測管，分別標記為對照管、實驗管，每管加入裸鼠靜脈血100 μl。②對照管加入FITC及PE標記的Ig同型對照各1 μl;實驗管加入CD45-PE及大鼠CD146-FITC。振蕩混勻，常溫避光孵育30分鐘。③每管加入紅細胞裂解液0.5 ml，混勻，避光孵育15 min;滴加流式液至5 ml并混勻，離心5 min(1500轉/分鐘);除去上清液，加入流式液0.5 ml，振蕩混勻，上機檢測。④上機前以標準熒光微球調整儀器的變異系數并穩定在2以內，以目標細胞群設門，上機后收集1萬個細胞，根據細胞發出的熒光測定表達率并計算CD45-CD146+細胞(aCECs)數。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0進行數據分析。正態分布的計量資料以±s表示。以P<0.05為差異有統計學意義。非正態分布的計量資料以中位數(肘)及四分位數間距(Q)表示，采用秩和檢驗進行統計。

2 結果

2.1 各組裸鼠治療前后腫瘤體積比較

同時用藥組和先恩度組治療前后腫瘤體積的差值均低于模型組(P<0.05)，但同時用藥組腫瘤增長較慢，與先恩度組比較有明顯統計學差異(P<0.05) (圖1，表1)。

圖1 各組腫瘤生長曲線

2.2 各組裸鼠外周血中CECs數量的比較

同時用藥組、先恩度組、模型組和空白對照組裸小鼠外周血中CECs的數量分別為(25.86±11.77)個/104個細胞、(77.25±24.02) 個/104個細胞、(14.71±11.07) 個/104個細胞和(12.90±11.20) 個/104個細胞，同時用藥組、模型組和空白對照組均明顯低于先恩度組(P均<0.01)，而同時用藥組、模型組和空白對照組之間的差異均無統計學意義，見圖2。

3 討論

我國自主研發人重組血管內皮抑素——恩度，與化療聯合取得較好的抗腫瘤治療效果。但與化療聯合的時序問題目前尚無定論。但也有學者認為，血管正常化只是1個短暫過程，產生的療效較小，先使用化療藥物大量殺傷腫瘤后，再行抗血管生成治療才能使患者得到最大獲益。因此，比較恩度聯合化療不同給藥時序的療效，為臨床制定最佳治療方案提供依據。

目前抗血管生成類藥物的療效評價尚無明確的生物標志物，評價抗血管生成治療藥物療效的方法包括內皮細胞的形態學觀察(如微血管密度)、腫瘤血管超微結構的觀察[1]、血管生成調節劑的檢測[2]、彩色多普勒測定血流、間接觀察腫瘤大小或腫瘤標志的監測及循環內皮細胞CECs檢測，其中CECs檢測因取材方便、操作簡易且可動態觀察其含量變化而成為首選評價療效方法[3]。大量文獻表明CECs可作為腫瘤的生物標記物，其含量與腫瘤進展和預后相關[4]，癌癥患者外周血中的CEC含量高于正常人，完全緩解后降至正常[5]。在進展期腫瘤患者中富含活化的CEC，通過促進新生血管生成從而影響腫瘤的演變及轉移[6-7]。

表1 第35天各組體積及抑瘤率(±s)

表1 第35天各組體積及抑瘤率(±s)

組別例數瘤體積/mm3療前療后差值/mm3P抑瘤率/%同時組88．56±4．5444．88±35．1236．32±30．580．020▲80先恩度組86．42±2．44118．88±74．22112．46±71．780．010△48模型組86．68±2．56221．52±96．13214．84±93．570．002?

注：▲為同時組與先恩度組差值的比較，△為先恩度組與模型組比較，*為模型組與同時組比較。

圖2 各組裸鼠中CECs數量比較

本研究，比較了恩度與紫杉醇不同給藥順序的抗腫瘤效應，同時也探討了不同給藥時序，CECs數量的變化。在抑瘤率方面，同時用藥組優于先恩度組，(80% vs 48%P<0.05),與袁靜等[8]報道一致。考慮化療后腫瘤負荷減輕，腫瘤細胞同步化進入處于G0/G1期，隨后恩度作用于G0/G1期，誘導細胞產生凋亡。在CECs數量方面，同時用藥組和先恩度組較模型組CECs數量明顯減少，同時用藥組的CECs數量最少，但與先恩度組比較無統計學意義。Wang等[9]發現，在化療聯合恩度治療非小細胞肺癌有效的患者中，其aCECs水平呈下降趨勢。國外類似研究的結果也顯示，非小細胞肺癌患者經紫杉醇聯合卡鉑治療后，aCECs數量下降[10]。化療藥物的腫瘤殺傷作用強，可迅速減少促血管生成因子(tumor angiogenesis factors，TAFs)，誘導CECs產生凋亡，恩度可以維持此作用，故CECs數量明顯降低。

綜上，化療聯合恩度，同時應用化療與恩度，待有效削減腫瘤體積后，再以抗血管生成藥物維持治療。治療后CECs數量下降則反映了CECs的凋亡和腫瘤消退，其變化可能可以幫助預測療效。

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