β-欖香烯注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞侵襲、遷移的作用及其相關(guān)機(jī)制

毛雨秋

肝癌惡性程度高、預(yù)后差，是消化系統(tǒng)比較多見的惡性腫瘤。手術(shù)切除仍是臨床治療肝癌的有效方式之一，但復(fù)發(fā)率較高[1-2]。術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、侵襲及轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。但腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未研究確切。據(jù)報(bào)道[3-4]，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可有效降解膠原原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)成分，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制具有密切關(guān)聯(lián)。β-欖香烯主要是由姜科植物中提取而來，是一種典型的抗腫瘤成分，體外研究表明，β-欖香烯注射液具有良好的抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞快速凋亡，但其具體作用機(jī)制尚不確切[5-7]。本研究旨在探討β-欖香烯注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)一步分析HepG-2細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG-2，購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 β-欖香烯注射液(由大連金港制藥廠提供，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥化實(shí)驗(yàn)室鑒定，純度為99.8%)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT，購于Sigma公司)，Transwell小室(Millipore公司)，胰蛋白酶(Bio SHARP公司)，β-actin(Sigma公司)，兔抗MMP-2/9抗體(Santacruz公司)，羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(Bio world公司)；電泳儀(Bio Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG-2細(xì)胞培養(yǎng) 以含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長貼壁達(dá)亞融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰酶消化，備用。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以胰酶消化，配置成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為105個(gè)/mL，接種于96孔板，100 μL/孔。分別加入濃度為0、10、20、30、50、100、200、400 μg/mL的β-欖香烯注射液處理24 h，各樣本設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加入5 μg/mL新鮮配置的MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸除上清；然后加二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔，于搖床震蕩10 min。以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm下的吸光度(OD490 nm)并詳細(xì)記錄，細(xì)胞活力指數(shù)=(實(shí)驗(yàn)組OD490 nm/陰性對(duì)照組OD490 nm)×100%。

1.2.3 細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞粘附能力 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，106個(gè)/孔，分別以濃度為0、10、20、30 μg/mL的β-欖香烯注射液處理24 h后，以含10% FBS的培養(yǎng)液重懸，接種于預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中，104個(gè)/孔，各孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后以甲醇固定粘附細(xì)胞15 min，加入0.1%的結(jié)晶紫染色液，清洗，風(fēng)干，以0.2% TritonX-100溶解，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔550 nm下的吸光度(OD550 nm)并詳細(xì)記錄。細(xì)胞粘附率=(實(shí)驗(yàn)組550 nm/陰性對(duì)照組OD550 nm)×100%。

1.2.4 Transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG-2細(xì)胞的侵襲及遷移情況 細(xì)胞樣本的分組及給藥方式同上。處理24 h后用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加至Transwell上室，另取600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基加入Transwell下室，24 h后取出Transwell小室，經(jīng)PBS洗3次，以棉簽擦去上室未穿過去的細(xì)胞，加入甲醇固定15 min，PBS洗3次，加0.1%的結(jié)晶紫染液，30 min后以自來水洗滌，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照并記錄，計(jì)算HepG-2細(xì)胞的遷移抑制率。侵襲實(shí)驗(yàn)的方法與遷移實(shí)驗(yàn)相似，不同之處是在上室加入50 μL 1∶8比例稀釋過的Matrigel基質(zhì)膠。于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況，拍照并記錄，計(jì)算HepG-2細(xì)胞遷移、侵襲抑制率，抑制率=(對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量/對(duì)照組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)MMP-2及MMP-9基因的表達(dá)情況 細(xì)胞樣本的分組及給藥方式同上。處理24 h后提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白濃度并調(diào)節(jié)一致。取50 μg蛋白上樣(β-actin為內(nèi)參)，以用10%的分離膠及5%的濃縮膠進(jìn)行SDS PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以封閉液在室溫下封閉1 h，加入一抗(兔抗MMP-2/9抗體，工作濃度為1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次，隨后加入二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，工作濃度1∶5 000)，室溫?fù)u床上緩慢搖動(dòng)1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，發(fā)光液發(fā)光后，凝膠成像儀下掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞活力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)β-欖香烯注射液濃度為50、100、200及400 μg/mL時(shí)，HepG-2細(xì)胞活力明顯降低，且HepG-2細(xì)胞的活力隨β-欖香烯注射液濃度的增大而明顯降低(P<0.05)，具有濃度依賴性。見圖1。因此本研究選取β-欖香烯注射液濃度0、10、20、30 μg/mL，以排除高濃度β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖活性的影響，而進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 MTT檢測(cè)β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞活力的影響

2.2 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞粘附能力的影響

細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著β-欖香烯注射液濃度的增大，HepG-2細(xì)胞的粘附率明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

圖2 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞粘附能的影響

2.3 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著β-欖香烯注射液濃度的加大，HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)量逐步降低，且β-欖香烯注射液濃度為20、30 μg/mL的HepG-2細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而遷移及侵襲抑制率顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.4 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，隨著β-欖香烯注射液濃度的加大，MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量均逐漸降低，且對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)的抑制作用更為顯著。見圖3。

3 討論

肝癌是目前導(dǎo)致人類死亡的主要惡性腫瘤之一，其中腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因。β-欖香烯是從姜科植物溫莪術(shù)中提取的萜烯類化合物。早在上世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)局部治療宮頸癌效果顯著。近年來研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯是溫莪術(shù)抗腫瘤作用的主要有效成份，其具有廣譜抗腫瘤作用，療效確切且毒副作用輕微，目前在臨床廣泛用于肺癌、惡性漿膜腔積液、消化道腫瘤、腦瘤或其它淺表性腫瘤的治療[8-9]。但有關(guān)β-欖香烯注射液抗腫瘤的作用機(jī)制尚不確切，本研究主要探討β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響，探討其抗腫瘤機(jī)制。

本研究中體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖活性具有明顯的選擇性抑制作用，其中當(dāng)β-欖香烯注射液濃度為50、100、200及400 μg/mL時(shí)，HepG-2細(xì)胞活力明顯降低，且HepG-2細(xì)胞活力隨β-欖香烯注射液濃度的增大而明顯降低，具有濃度依賴性，因此本研究選取β-欖香烯注射液濃度為0、10、20、30 μg/mL，排除高濃度β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖活性的影響。粘附是HepG-2腫瘤細(xì)胞侵襲的開始，腫瘤細(xì)胞表面特定的受體可與正常細(xì)胞基膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等粘連，在蛋白水解酶及相關(guān)因子的作用下，侵襲基膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)行快速侵襲性生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。本研究中通過細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著β-欖香烯注射液濃度的增大，HepG-2細(xì)胞的粘附率明顯降低，提示β-欖香烯注射液可有效降低HepG-2細(xì)胞的粘附能力，阻礙其后續(xù)的侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，本研究中采用與天然基膜極為相似的基質(zhì)膠鋪在Transwell小室膜上，進(jìn)行Transwell小室侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)，形象地在體外模擬腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移過程，結(jié)果顯示，HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)量隨β-欖香烯注射液濃度的增加而呈逐漸降低趨勢(shì)，且當(dāng)濃度為20、30 μg/mL時(shí)HepG-2細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而遷移及侵襲抑制率顯著升高。提示β-欖香烯能有效地降低HepG-2肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力，且呈劑量依賴性，與相關(guān)研究[11]結(jié)果相似。

表1 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響

與0 μg/mL比較，*為P<0.05，**為P<0.01；##為與10 μg/mL比較，P<0.01。

圖3 β-欖香烯注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、連續(xù)的多步驟的過程，也是導(dǎo)致腫瘤患者惡性程度升高的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞具有從原發(fā)部位遷移并進(jìn)行增殖的能力，其不僅與腫瘤細(xì)胞自身改變有關(guān)，也與宿主微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞間的相互作用有關(guān)[12]。MMPs是參與細(xì)胞外基質(zhì)和基膜降解的蛋白水解酶，其中MMP-2及MMP-9是典型的MMPs，HepG-2細(xì)胞中MMPs的結(jié)構(gòu)功能及水平的變化與HepG-2細(xì)胞侵襲及遷移密切相關(guān)。本研究中Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著β-欖香烯注射液濃度的加大，MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)量均逐漸降低，且對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)的抑制作用更為顯著，提示β-欖香烯注射液可明顯減少細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的降解，降低肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

綜上，β-欖香烯注射液可顯著降低肝癌HepG-2細(xì)胞的粘附能力，并抑制其侵襲及遷移，其作用機(jī)制很可能與其明顯下調(diào)機(jī)體MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)相關(guān)，但具體的抗肝癌作用機(jī)制仍需臨床進(jìn)一步深入研究。

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