三陰性乳腺癌中TOPOⅡα表達以及預后關系研究

徐國萍 王 杰 楊 莉 何 奇

三陰性乳腺癌是1種具有較強臨床侵襲性表現的乳腺癌，是為雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)以及人體表皮生長因子受體2(CerbB-2)免疫組化標記均為陰性的1種特殊類型乳腺癌[1]，約占乳腺癌的15%。從目前來看臨床治療上因缺乏針對三陰性乳腺癌的靶向藥物而導致治療效果的不佳以及傳統預后指標的不明確使乳腺癌預后不良的案例屢見不鮮，所以找出對三陰性乳腺癌敏感，并且對其預后有重要參考價值的生物分子指標顯得非常重要。故本文針對三陰性乳腺癌的分子生物學特征進行深入探討作為判斷腫瘤預后以及尋找靶點便于臨床治療有著一定的臨床指導意義。本文采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物技術(streptavidin-biotin-peroxidsae complex method,SABC)檢測186例三陰性乳腺癌患者病理組織中TopoⅡα的表達，并綜合患者的年齡、腫瘤大小和病理類型、臨床分期、組織學分級和有無淋巴結轉移情況展開深入的分析和討論。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2016年12月我院收治的186例經病理證實的女性三陰性乳腺癌患者。年齡≥60歲的43例，<60歲的143例，中位年齡69歲。其中腫瘤直徑>5 cm者9例，≤2 cm者101例，>2 cm且≤5 cm者76例。病理組織學類型：浸潤性導管癌165例，導管原位癌21例。腋窩淋巴結轉移陰性者123例，腋窩淋巴結轉移陽性者63例。TNM分期：Ⅰ期72例，Ⅱ期92例，Ⅲ期22例。組織學分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級72例，Ⅲ級102例。所有患者均進行常規胸片以及腹腔B超，并確定腫瘤分期和排除其他腫瘤的可能。經過穿刺活檢以及外科手術的方式采集三陰性乳腺癌的組織標本，并應用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，DAB顯色。另選擇40例乳腺增生患者以及40例導管上皮不典型增生患者為良性對照。

1.2 主要試劑

鼠抗人TopoⅡα單克隆抗體及其相關試劑主要購于上海拜力生物科技有限公司。

1.3 方法

采用SABC免疫組化法[2]。先將組織切片用EDTA修復液抗原，緩沖液切片PBS沖洗。于標本上滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。滴加Ⅰ抗(鼠抗人TopoⅡα單克隆抗體)，4 ℃放置24 h。生物素化二抗(羊抗兔IgG)滴加切片。切片上滴加SABC，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色，蒸餾水沖洗。再使用蘇木精復染、鹽酸酒精分化。酒精脫水，用二甲苯透明、樹膠封片。用正常的PBS代替一抗作為陰性對照，實驗人員按照試劑盒要求嚴格進行操作。

1.4 結果評定標準

所有標本切片染色后均由研究者和病理科醫生通過雙盲法讀片。每例切片在光鏡下選取5高倍鏡視野進行結果判定，免疫組化陽性反應為出現棕褐色顆粒并參照二級計分法：①按照陽性細胞計數：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；②按照染色深淺：無染色為0分，黃色1分，棕黃色2分，棕褐色為3分。兩者得分乘積≥4～6分為陽性表達，7～9分為強陽性表達，<4分為陰性表達。

1.5 統計學處理

數據應用SPSS 20.0軟件分析，計數資料應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TopoⅡα在三陰性乳腺癌中的表達情況

TopⅡα主要定位于細胞核染成棕黃色。186例三陰性乳腺癌組織中TopoⅡα陽性率表達率為70.9%(132/186)，與40例乳腺增生組織中TopoⅡα陽性率表達[27.5%(11/40)]以及40例導管上皮不典型增生組織中TopoⅡα陽性表達率[22.5%(9/40)]相比，差異具有統計學意義。在165例浸潤性導管癌中TopoⅡα陽性或強陽性表達有122(73.9%)例，與在21例導管原位癌[10例(47.6%)]相比，差異具有統計學意義。TopoⅡα表達在乳腺增生組織轉變為三陰性乳腺癌以及乳腺癌發生發展的過程中水平不斷提高，TopoⅡα可能與乳腺增生組織的惡性轉變有關,見表1。

表1 TopoⅡα在乳腺疾病組織中的表達情況/例

2.2 TopoⅡα表達與浸潤性導管癌各臨床病理指標的關系

三陰性乳腺癌中TopoⅡα表達與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、TNM臨床分期均無關(P>0.05)，TopoⅡα表達與淋巴結轉移有關，TopoⅡα陽性表達率在腋窩淋巴結轉移者中高達80.9%，在未發生淋巴結轉移者中僅有49.6%，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤[3]，約占所有惡性腫瘤的23%。其中三陰性乳腺癌約占所有乳腺癌病理類型的15%左右，具有組織學分級高、病理類型幾乎均為導管癌、腫瘤細胞多表達等特點，由于其雌、孕激素受體均為陰性，使其無法從較為成熟的乳腺癌內分泌治療以及靶向治療中收益，使得在臨床治療中濫用化療藥物給患者帶來不良的預后以及經濟方面的困難，因此對這一群體的研究顯得非常重要和迫在眉睫。故本文從蛋白質的角度來選擇癌癥發生發展中的特異性指標TopoⅡα來研究希望可以為臨床治療提供有效的信息。

DNA拓撲異構酶(Topo)主要存在于真核及原核細胞中并參DNA復制、轉錄、重組，DNA拓撲異構酶可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[4]。TopoⅡ又稱旋轉酶，具有α和β兩種同工酶，TopoⅡα位于增殖細胞中，通過在DNA的復制過程中，使其形成1個雙鏈缺口從而使得雙鏈DNA與斷裂的DNA通過此缺口來進行重新連接使得下一步解鏈復制得以進行，TopoⅡα蛋白在細胞分裂時 DNA 轉錄、重組、復制，染色體固縮和分離及染色體結構的保持上起重要作用[5]。Bria等[6]發現，TopoⅡα的表達具有周期特異性，在細胞周期S期-G2/M期TopoⅡα含量快速上升，有絲分裂后(G1、G0期)下降，TopoⅡα蛋白陽性提示腫瘤細胞處于增殖狀態，可反映腫瘤細胞的增殖活性。TopoⅡα 的蛋白編碼位于人染色體17q12-21這一區域內，這意味著無論TopoⅡα擴增或缺失都預示著不良的預后。也有研究表明，TopoⅡα在乳腺癌組織的表達與預后指標存在一定的關系[7]。在本實驗的結果中可以看出從乳腺增生組織發展成原位癌再進一步成為浸潤性導管癌的過程中，TopoⅡα的表達逐漸增強，染色程度有黃色發展成棕褐色，在腋窩淋巴結轉移的過程中也發現了TopoⅡα的陽性表達增高。這進一步說TopoⅡα的表達使得細胞復制加快并隨著腫瘤的不斷增殖，惡性程度的不斷提高而升高。這可以從正面反映TopoⅡα可以預示腫瘤的發生發展以及預后的關系。在目前三陰性乳腺癌的臨床治療中，將蒽環類和紫杉醇類藥物納入輔助化療方案已經基本達成共識。蒽環類藥物的作用機制是抑制TopoⅡα,通過與TopoⅡαDNA復合體相互作用,導致雙鏈DNA斷裂隨后發生細胞凋亡[8]。然而,蒽環類藥物的抗腫瘤過程中膜脂過氧化導致自由基形成,具有心臟毒性。所以,應用蒽環類藥物治療乳腺癌之前,要權衡預期的療效和副作用,選擇可能最大受益的個體,有鑒于此,需深入研究TopoⅡα的基因狀況而TopoⅡα為蒽環類抗生素的作用靶點，腫瘤內TopoⅡα表達能直接影響到化療的整體療效水平，這點與韓艷春等[9]的研究觀點一致。是否在聯合化療中添加TopoⅡα抑制劑來提高腫瘤對抗腫瘤藥物的敏感性以獲得更好的療效和預后使得TopoⅡα的檢測在臨床治療的過程中變得至關重要，也在用藥方面提出了指導性意見，值得進一步推廣和深入的研究。在本實驗中，研究TopoⅡα在三陰性乳腺浸潤性導管癌的病理指標時發現，TopoⅡα在發生腋窩淋巴結轉移時陽性表達率高達80.9%顯著高于未發生腋窩淋巴結轉移患者的陽性表達率49.6%，但與患者的年齡大小，腫瘤的組織學分級以及TNM分期無關。這證明了TopoⅡα的高表達率能提示腫瘤出現淋巴結轉移的情況，能為腫瘤惡性程度以及出現轉移做出預示和評價。也有研究表明TopoⅡα高表達也可能與腫瘤發生遠端轉移有關[10]。另外據報道，在TopoⅡα陽性表達高度時，患者采用單一藥物阿霉素進行治療，其癥狀緩解程度相對較高，體內TopoⅡα高度表達的乳腺癌患者依然可以通過蒽環類抗腫瘤藥物取得顯著的療效[11]。

表2 浸潤性導管癌TopoⅡα表達與臨床病理特征的關系/例

不僅僅在三陰性乳腺癌中,李晶等人發現TopoⅡα陽性表達與胃癌的浸潤程度，淋巴結轉移，脈管內癌栓有顯著的相關性[12]；屈王蕾等發現TopoⅡα表達隨著宮頸癌前病變的嚴重程度而上調，可能參與宮頸上皮的異常增殖和惡性轉變[13]。

綜上所述，TopoⅡα的高度表達患者腫瘤惡性程度高，出現淋巴結轉移以及腫瘤轉移的可能性高，檢測TopoⅡα可以為預后提供評價。免疫組化法易于檢測TopoⅡα可為患者制定個體化化療方案以及用藥指導提供可靠的依據。TopoⅡα可作為化療用藥選擇的指導標準。TopoⅡα在胃癌、宮頸癌等其他癌癥中也有表達，TopoⅡα值得研究人員和學者們進行更加深入的研究和學習。

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