高密度CO2對蝦肌球蛋白微觀形貌的影響

摘 要：以凡納濱對蝦肌球蛋白為研究對象，用原子力顯微鏡觀察高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）處理壓強、溫度和時間對肌球蛋白微觀形貌的影響，探討DPCD處理過程中肌球蛋白的聚集行為特征。結果表明：在不同的DPCD處理壓強、溫度和時間條件下，肌球蛋白變性和聚集的程度有顯著差異；DPCD誘導肌球蛋白變性聚集過程中，不僅有熱效應引起的蛋白質分子間的相互作用，還有高壓下CO2與蛋白質分子間的相互作用。

關鍵詞：高密度CO2；微觀形貌；分子粒徑；肌球蛋白；凡納濱對蝦

Abstract： In the present research， the effect of dense phase carbon dioxide （DPCD） on the micromorphology of myosin extracted from Litopenaeus vannamei muscle was studied by atomic force microscopy （AFM）. DPCD treatments were carried out at different pressures and temperatures for different durations. The aggregation characteristics of myosin during the treatments were explored. The results showed that the degree of myosin denaturation and aggregation varied greatly as a function of pressure， temperature and treatment time. DPCD induced myosin denaturation and aggregation by thermally inducing protein-protein interaction as well as by inducing interaction between the protein and carbon dioxide at high pressure.

Keywords： dense phase carbon dioxide； micromorphology； protein particle diameter； myosin； Litopenaeus vannamei

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001

中圖分類號：TS254.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）02-0001-07

引文格式：

劉書成， 董安迪， 羅帥， 等. 高密度CO2對蝦肌球蛋白微觀形貌的影響[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001. http：//www.rlyj.pub

LIU Shucheng， DONG Andi， LUO Shuai， et al. Effect of dense phase carbon dioxide on micromorphology of myosin from Litopenaeus vannamei muscle[J]. Meat Research， 2018， 32（2）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802001. http：//www.rlyj.pub

天然蛋白質在外界環境（加熱、溶液pH值、高壓等）的誘導作用下，分子的空間結構會發生改變，蛋白質分子內部、蛋白質-蛋白質、蛋白質-溶劑之間的作用力也會隨之發生改變，最終導致蛋白質的變性聚集，形成新的結構[1]，典型的表現就是肌球蛋白的凝膠化過程。肌球蛋白的凝膠化能力是其重要的食品功能特性之一，對于肉糜類產品（如肉丸、火腿腸等）的質構形成具有非常重要的作用。加熱、pH值、NaCl或超高壓等處理均可以誘導肌球蛋白形成凝膠[2-7]，評價一種處理方法能否使肌球蛋白形成凝膠，首先是看該處理方法能否使肌球蛋白發生變性和聚集，形成大的凝聚物，因為大的凝聚物的產生是形成優良彈性凝膠的前提[8]。

高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）是近年來興起的一種非熱食品加工技術，主要用于食品的殺菌和鈍酶，有研究發現一定強度的DPCD處理也能使食品蛋白質發生變性和聚集[9-12]，甚至形成凝膠[13-17]。本課題組前期研究表明，DPCD能夠誘導凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）肉糜形成凝膠，而且所制備凝膠的感官特性、營養特性、微觀結構和質構特性等都顯著優于熱誘導所形成的凝膠[17]。為闡明DPCD誘導蝦肉糜形成凝膠的機制，本研究以凡納濱對蝦肌球蛋白為對象，利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理溫度、壓強和處理時間對肌球蛋白微觀形貌的影響，探討DPCD處理過程中肌球蛋白的聚集行為特征，為利用DPCD開發優質的肉類凝膠制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦，規格50～60 尾/kg，購于廣東省湛江市霞山區東風水產批發市場，保活運至實驗室，用自來水清洗干凈后備用。

Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物技術有限公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二硫代蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（均為分析純） 廣州市齊云生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、SDS蛋白上樣緩沖液 碧云天生物技術研究所；即用型蛋白分子質量標準（寬） 寶生物工程（大連）有限公司；CO2（純度99.9%） 湛江氧氣廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HA221-50-10-C超臨界裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；DYCZ-24DN雙垂直迷你電泳儀、DYY-6C雙穩定時電泳儀電源 北京六一儀器廠；5417R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HR3865/00組織勻漿機 荷蘭飛利浦公司；JYL-C022絞肉機 山東九陽股份有限公司；Bruker Multimode 8掃描探針顯微鏡 德國布魯克公司；云母片 長春市泰元氟金云母有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Hwang等[18]的方法。新鮮蝦肉攪碎后，稱取肉樣，加入5 倍體積（m/V）的20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），均質后離心（5 500×g，10 min），取沉淀，重復上述過程2 次；向所得沉淀中加入3 倍體積

（m/V）的提取液（包含0.45 mol/L的KCl、5 mmol/L的ATP、7.5 mmol/L的MgCl2和0.15 mmol/L的DTT，pH 6.4），攪拌15 min后離心（10 000×g，10 min）；4 層紗布過濾后，取濾液與9 倍體積（V/V）的預冷蒸餾水混合，靜置10 min，離心（6 000×g，10 min）得沉淀；向沉淀中加入緩沖液（包含3 mol/L的KCl、0.6 mmol/L的DTT和0.12 mol/L的Tris-Maleate，pH 7.5），沉淀與緩沖液的配比為5∶1（m/V），于4 ℃靜置過夜；再加入包含0.11 mol/L

的ATP、55 mmol/L的MgCl2和5.5 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol-bis-（2-aminoethyl）ether-N，N，N，N-tetraacetic acid，EGTA）的溶液（pH 7.5），沉淀與溶液的配比為10∶1（m/V），于4 ℃靜置2 h；向上述溶液中加入硫酸銨（室溫條件下1 L溶液中添加243～277 g硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為40%～45%），用來分離純化肌球蛋白，離心（10 000×g，15 min）；將沉淀置于0.6 mol/L KCl-20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）中透析至無SO42-檢出，期間更換透析液，整個過程中，溶液保持在4 ℃條件下。將透析后的溶液離心（10 000×g，15 min），上清液即為凡納濱對蝦肌球蛋白溶液。

用SDS-PAGE測得上述肌球蛋白溶液的肌球蛋白純度為96%；采用Lowry法[14]，以牛血清蛋白為標準品，測得溶液的蛋白質質量濃度為12～16 mg/mL。使用時稀釋到所需質量濃度。

1.3.2 DPCD處理

將1.3.1節所得肌球蛋白溶液稀釋至0.01 mg/mL，取3 mL于試管中，用于DPCD處理。

間歇式DPCD處理流程參考張良等[19]的方法。實驗開始時，首先打開制冷及冷卻循環，設置處理釜所需溫度，然后將樣品放入處理釜中，密封，開啟高壓泵泵入CO2氣體，待壓強上升至所需壓強，關閉高壓泵，封閉進出處理釜的閥門，維持處理釜內所需的壓強和溫度，靜態處理一段時間后，卸壓取出樣品，即完成一次處理。

設置處理溫度分別為30、35、40、45、50、60 ℃（處理壓強25 MPa，處理時間30 min），處理壓強分別為5、10、15、20、25、30 MPa（處理溫度45 ℃，處理時間30 min），處理時間分別為5、10、15、20、30、40 min（處理溫度45 ℃，處理壓強25 MPa），利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理溫度、壓強和處理時間對肌球蛋白微觀形貌的影響。將水浴熱處理設為對照組，水浴熱處理的溫度水平與DPCD處理一致，處理時間30 min。

1.3.3 原子力顯微鏡掃描

掃描探針顯微鏡的探針型號為MPP-11100-10（Rtesp）；探針材料為0.01～0.0025 Ohm-cm Antimony （n）doped Si；探針懸臂規格為厚度3.75 μm、長度125 μm、寬度35 μm、共振頻率300 kHz、力常數40 N/m；

探針正反面均無涂層。工作模式為智能模式，掃描范圍2 μm×2 μm，掃描速率2 Hz，掃描管型號7997JVLR。

樣品前處理：將蝦肌球蛋白溶液旋涂到預先處理好的干凈云母片上，用氮氣吹干，制成測試樣品。蛋白質顆粒的粒徑可以用干燥狀態下從云母片基底表面到蛋白質顆粒表面的垂直距離表示，原子力顯微鏡掃描圖還可以反映蛋白質的聚集程度。

1.4 數據處理

利用掃描探針顯微鏡自帶的Nanoscope Aualysis分析軟件（德國布魯克公司）對掃描圖進行分析；隨機選擇10 個蛋白質顆粒，計算其平均粒徑大小，結果用平

均值±標準差表示；用JMP 10.0軟件（賽仕軟件有限公司）對數據進行方差分析和Tukeys HSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 未處理凡納濱對蝦肌球蛋白的微觀形貌

由圖2～4可知，無論是DPCD處理還是單純熱處理，隨著處理溫度的增加，蝦肌球蛋白逐步發生聚集現象

（P<0.05），分子平均粒徑也顯著增加（P<0.05），且當處理溫度高于40 ℃后，肌球蛋白的聚集均更加顯著（P<0.05），這主要是由于凡納濱對蝦肌球蛋白的熱變性溫度為42.8 ℃[20]，當處理溫度接近或高于變性溫度后，肌球蛋白就會逐漸發生變性并聚集。在相同溫度條件下，DPCD處理的肌球蛋白的分子平均粒徑顯著小于單獨熱處理（P<0.05），說明相同溫度條件下DPCD誘導肌球蛋白的聚集程度弱于單純熱處理，這可能是由于肌球蛋白在DPCD處理過程中不僅受熱效應的影響，還受到高壓下CO2分子效應的影響。

在單純的熱處理過程中，主要是溶液中的肌球蛋白分子間的相互作用；而在DPCD處理過程中，不僅存在肌球蛋白分子間的相互作用，還存在DPCD與水分子的相互作用和DPCD與蛋白質分子間的相互作用。DPCD與水分子的相互作用可以使溶液的pH值下降，改變肌球蛋白分子周圍的微環境，可能使蛋白質發生變性[21]；DPCD與蛋白質分子間的相互作用（如疏水相互作用、氫鍵、靜電作用等[22-23]）可能會減弱蛋白質分子間的相互作用。

在肌球蛋白受熱誘導形成凝膠的過程中，主要是熱效應使肌球蛋白發生變性，進一步引起肌球蛋白分子之間頭部與頭部和尾部與尾部的相互作用，從而發生聚集，形成凝膠。Sharp等[24]研究肌球蛋白分子的熱誘導現象，發現在40 ℃條件下肌球蛋白分子通過頭部聚集形成球狀低聚物，50 ℃條件下低聚物會進一步發生聚集，溫度達到60 ℃時形成具有一定粒徑分布的聚合物，在這個過程中肌球蛋白尾部的作用較弱。Hayakawa等[25]利用透射電子顯微鏡觀察不同溫度處理后雞胸肉肌球蛋白分子的微觀形貌變化，也發現肌球蛋白分子頭部之間的聚集作用始終占主導地位。

在肌球蛋白的DPCD處理過程中不僅有熱效應，還有高壓下CO2與蛋白質分子間的相互作用[23]；隨著溫度的升高，CO2的分子熱運動加劇，增加了CO2與蛋白質的接觸機會，從而增強了其相互作用。可能正是由于高壓下CO2與蛋白質間的相互作用減弱了蛋白質分子間的相互作用，隨著處理溫度的升高，肌球蛋白的聚集程度減弱。

Li Renjie等[26]用高壓CO2處理類甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP），并用原子力顯微鏡觀察到了同樣的實驗現象。Hu Wanfeng等[27]用35 ℃和8 MPa的高壓CO2處理多酚氧化酶20 min，其分子粒徑從116 nm增加到627 nm，均與本研究的結果一致。因此，DPCD處理與熱處理均能使蛋白質發生變性和聚集，但是單純熱處理與DPCD處理對蛋白質的影響機制有顯著差異。

2.3 DPCD處理壓強對凡納濱對蝦肌球蛋白微觀形貌的影響

由圖5～6可知，與未處理時相比，5～10 MPa壓強范圍內的蝦肌球蛋白發生了顯著聚集，分子平均粒徑逐漸增大（P<0.05），形成了較大的形狀不規則的聚集體；當壓強為15 MPa時，蝦肌球蛋白的聚集程度減弱，分子平均粒徑逐漸減小（P<0.05）；當壓強在20～30 MPa范圍內時，蝦肌球蛋白的分子平均粒徑小于未處理組

（P<0.05）。在5～10 MPa范圍內時，CO2主要以氣體和亞臨界氣體狀態存在，在水中的溶解度相對較低，此時肌球蛋白較大程度的聚集可能主要是由熱效應引起的，而CO2與蛋白質間的相互作用較弱。隨著處理壓強的增加，CO2進入超臨界狀態，在水中的溶解度也大大增加，顯著增強了DPCD與蛋白質間的相互作用，使蛋白質分子之間的相互作用相對減弱，從而使肌球蛋白的聚集程度減弱[23]。

Li Renjie等[26]用高壓CO2處理TLP，并用原子力顯微鏡觀察發現，在20 MPa、35 ℃條件下，DPCD處理15 min后，部分TLP聚集，形成規則、致密的聚集體，也有部分TLP被解離，形成更小、不規則的顆粒；Hu Wanfeng等[27]發現，當DPCD處理壓強從0.1 MPa增加到1.0 MPa時，大豆蛋白溶液pH值從6.4降至4.9，蛋白質粒徑從0.2 μm增至0.5 μm，這均與本研究的結果一致。因此，DPCD既能使蛋白質發生聚集，又能使其發生解離。一般來說，在較低的處理壓強下，蛋白質分子間的相互作用強于CO2與蛋白質間的相互作用，蛋白質發生變性后隨即發生聚集，分子平均粒徑變大；當處理壓強較高時，CO2與蛋白質間的相互作用增強，使蛋白質分子間的相互作用減弱，蛋白質雖然發生了變性，但聚集較弱，分子平均粒徑較小。

2.4 DPCD處理時間對凡納濱對蝦肌球蛋白微觀形貌的影響

由圖7～8可知，DPCD處理5 min即可使蝦肌球蛋白發生明顯的聚集，分子平均粒徑顯著增加（P<0.05），此時形成的聚集體緊密，而且顆粒粒徑大小呈現不均勻分布；隨著處理時間的增加，肌球蛋白分子的聚集程度顯著減弱（P<0.05），這同樣與DPCD與肌球蛋白分子之間的相互作用有關。處理時間短時可能熱效應占主導地位，肌球蛋白分子間的相互作用強于DPCD與蛋白質間的相互作用；隨著處理時間增加，DPCD與蛋白質的相互作用逐漸增強，使肌球蛋白分子之間的相互作用減弱，從而使肌球蛋白的聚集程度減弱。

由以上分析可知，DPCD能夠誘導肌球蛋白發生變性和聚集，但是在不同的DPCD處理強度下，肌球蛋白變性和聚集程度是有差異的，其機制可能包括以下幾方面：1）DPCD能使溶液的pH值下降，改變溶液的微環境[21]；2）DPCD能使蛋白質的α-螺旋含量下降、β-折疊含量上升，促進蛋白質的變性和聚集[22，28]；3）DPCD與蛋白質分子間的相互作用（如疏水相互作用、氫鍵、靜電相互作用等[23]）能夠影響蛋白質分子間的相互作用等。

3 結 論

利用原子力顯微鏡觀察DPCD處理對凡納濱對蝦肌球蛋白分子微觀形貌的影響，結論如下：1）純化的肌球蛋白分子呈橢圓球形、表面光滑并且有清晰的邊緣，分子平均粒徑為4.78 nm；2）DPCD處理能誘導肌球蛋白發生變性和聚集，但在不同的處理強度下，肌球蛋白變性和聚集的程度有顯著差異；3）DPCD誘導肌球蛋白變性和聚集過程中，不僅有熱效應引起的蛋白質分子間的相互作用，而且還有高壓下CO2與蛋白質分子間的相互作用。本研究結果為DPCD誘導蛋白質形成凝膠的機制研究和技術開發提供了參考。

參考文獻：

[1] TOTOSAUS A， MONTEJANO J G， SALAZAR J A， et al. A review of physical and chemical protein-gel induction[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2002， 37（6）： 589-601. DOI：10.1046/j.1365-2621.2002.00623.x.