乳酸菌混合快速發酵低鹽型酸肉的工藝優化

摘 要：將侗族酸肉中篩選出來的彎曲乳桿菌SR6和戊糖片球菌SR4-2混合作為酸肉發酵劑，以感官評分和pH值為評價指標，通過單因素試驗和L9（34）正交試驗確定并優化人工接種快速發酵酸肉的工藝參數。以自然發酵酸肉為對照，對采用本研究所得工藝條件加工酸肉的各品質指標進行動態監測。結果表明：單因素試驗和正交試驗確定的酸肉最佳發酵工藝條件為食鹽添加量8%、發酵劑接種量2.0%、糯米飯添加量45%、發酵溫度15 ℃；在此條件下利用雙菌株發酵所得酸肉的pH值快速降低，游離氨基酸總量顯著高于對照組（P<0.05），將酸肉發酵時間縮短為30 d，此時即達到并優于傳統發酵酸肉的品質，并提高了產品的營養和安全性。

關鍵詞：酸肉；乳酸菌；工藝優化；快速發酵；低鹽肉制品

Abstract： In this study， two lactic acid bacteria （LAB） strains namely Lactobacillus curvatus SR6 and Pediococcus pentosaceus SR4-2， screened from Dong ethnical sour meat， were used as a mixed starter culture for rapid fermentation of low-salt sour meat. The fermentation process was optimized based on sensory evaluation score and pH value using one-factor-at-a-time

method and an L9 （34） orthogonal array design. Quality indicators were measured dynamically during the optimized process in comparison to natural fermentation. The optimal fermentation conditions were obtained as follows： 8% salt， inoculum amount of 2%， 45% glutinous rice and fermentation at 15 ℃. pH value rapidly decreased during the fermentation process and the total amount of free amino acids was significantly increased when compared with natural fermentation （P < 0.05）. The optimized process took a shorter period of 30 d to obtain better sour meat quality in terms of improved nutritional quality and safety compared with the traditional process.

Keywords： sour meat； lactic acid bacteria； process optimization； rapid fermentation； low-salt meat product

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802004

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）02-0020-08

引文格式：

謝垚垚， 楊萍， 吳展望， 等. 乳酸菌混合快速發酵低鹽型酸肉的工藝優化[J]. 肉類研究， 2018， 32（2）： 20-27. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201802004. http：//www.rlyj.pub

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傳統酸肉為風味獨特的發酵產品，色鮮味美，是侗、苗、布依族等少數民族生活中的重要肉食產品[1]，深受民眾喜愛。但傳統酸肉加工受季節的限制，只能一次發酵、多次食用，生產工藝為依據傳統經驗進行的自然發酵，發酵周期長，一般需要3～6 個月才能食用，民間生產的差異性和隨機性很大，發酵條件難控制，產品質量參差不齊；其次，傳統加工主要靠高濃度的食鹽腌制來延長產品的保質期，長期食用對人體健康有害。為改進傳統酸肉的生產工藝，以適應現代化規模生產的要求，一些學者進行了工藝改良研究：代小容[2]對渝黔地區傳統酸肉的生產工藝進行優化，減少食鹽用量至4.5%，但發酵時間仍需60 d；姜亞等[3]以酸肉的揮發性鹽基氮含量、酸價、過氧化值以及亞硝酸鹽含量為評價指標，應用L9（34）正交試驗優化酸肉發酵工藝，結果表明，糯米粉添加量、食鹽添加量、發酵溫度和發酵時間4 種因素是影響酸肉安全的主要因素，但發酵時間為2 個月。

自然發酵酸肉中的優勢菌群主要是乳桿菌屬和片球菌屬，其生長代謝與酸肉滋味的形成密切相關[4]，通過接種發酵劑能夠改進傳統發酵肉制品的生產工藝。孔保華等[5]將分離自傳統發酵制品的乳酸菌接種到哈爾濱風干腸中，發現這能夠改善產品品質、縮短產品的生產周期。Erkkil等[6]將乳酸菌接種于發酵香腸中，發現乳酸菌會迅速增殖成為優勢菌，并在40 h內使pH值降低至5以下。

Nie Xiaohua等[7]研究植物乳桿菌和戊糖片球菌對發酵肉制品蛋白質水解特性的影響，結果表明，二者有助于發酵肉制品風味的形成。Andreja等[8]用清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌生產干發酵香腸，發現游離脂肪酸的含量顯著增加，尤其是油酸和亞油酸，這有助于產品營養和風味的提高。Casaubri等[9]將S. xylosus CVS11、L. curvatus AVL3、

S. xylosus FVS21接種在意大利香腸中，使得香腸中的蛋白質發生了水解，肌球重鏈蛋白顯示出比肌動蛋白更易降解的特性，同時產品中游離氨基酸和非蛋白氮的含量大大增加。

為使傳統酸肉制品滿足現代消費者對營養性和安全性的需求，深入研究有益微生物在酸肉發酵中的作用和功能，開發優良的肉制品發酵劑具有十分重要的意義。本研究利用2 株源于貴州侗族原生態酸肉制品的乳酸菌，將其混合，作為發酵劑應用于低鹽型酸肉的發酵，以pH值和感官評價為指標，通過單因素及正交試驗對酸肉發酵工藝進行優化，確定酸肉快速發酵的工藝參數。并對采用優化工藝制作的酸肉不同發酵時期的質量指標變化情況進行動態監測與分析，以期得到適合酸肉生產的發酵工藝，為實現傳統酸肉的標準化生產、縮短生產周期、降低食鹽用量以及提高產品風味和營養提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬五花、干辣椒粉、食鹽、花椒、姜均為市售，糯米為侗族特產的香禾糯，辣椒為侗族地區特產。

本研究所采用的2 株乳酸菌為彎曲乳桿菌SR6（Lactobacillus curvatus SR6）和戊糖片球菌SR4-2（Pediococcus pentosaceus SR4-2），由實驗室前期從侗族酸肉樣品中分離鑒定[10]，再經過抗氧化性復篩獲得[11]。

在耐受能力實驗中，2 株乳酸菌均表現出良好的耐酸、耐滲透壓、耐亞硝酸鹽及人工模擬胃腸液耐受能力，可用于功能性發酵肉食品的開發[12-13]。對照組為不添加乳酸菌，按照傳統工藝加工的自然發酵型酸肉。

MRS培養基、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、VRBD瓊脂培養基 北京陸橋技術股份有限公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、硝酸銀（均為分析純） 貴州省博奧瑞杰生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

WSC-3B型便攜式精密色差儀 上海儀電物理光學儀器有限公司；HPX-9082 MBE型數顯電熱培養箱

上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HZQ-X100型恒溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；Testo205型便攜式

pH計 深圳德圖儀表有限公司；HD-4型智能水分活度測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；L-8800型氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 酸肉制作工藝

課題組到貴州省黔東南苗族侗族自治州黎平縣侗族村寨進行實地考察，侗族酸肉的制作工藝如圖1所示。

1.3.2 單因素試驗

以感官評分和pH值為評價指標，分別考察食鹽添加量、發酵劑接種量、糯米飯添加量和發酵溫度對發酵酸肉產品的影響。每個樣品的原料肉質量為500 g。

將食鹽添加量分別設為4%、6%、8%、10%、12%，發酵劑接種量2%，糯米飯添加量45%，15 ℃條件下發酵30 d；將發酵劑接種量分別設為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（彎曲乳桿菌SR6∶戊糖片球菌

SR4-2=1∶1），食鹽添加量8%，糯米飯添加量45%，15 ℃條件下發酵30 d；將糯米飯添加量分別設為35%、40%、45%、50%、55%，食鹽添加量8%，發酵劑接種量2.0%，15 ℃條件下發酵30 d；將發酵溫度分別設為5、10、15、20、25 ℃，食鹽添加量8%，發酵劑接種量2%，糯米飯添加量45%，發酵30 d。以上條件比例均以占五花肉的質量百分比計算。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上設計正交試驗，確定酸肉的最佳制作工藝。正交試驗因素及水平如表1所示。

1.3.4 產品的感官評價

參考俞彥波等[14]的方法。由10 名專業人士組成品評小組，分別對產品的顏色、風味進行打分，進行綜合感官評價，滿分100 分。酸肉的感官評分標準如表2所示。

1.3.5 微生物測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]和GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[16]。

1.3.6 理化指標測定

在制作2 組酸肉后立即收集樣品（即發酵0 d）進行測定，之后在發酵15、30、60、90、120、150、180 d時分別取樣測定。

1.3.6.1 pH值

將樣品切成2 cm厚，用Testo205便攜式pH計進行測定。

1.3.6.2 總酸含量

參照李華麗[17]的方法。

1.3.6.3 氨基酸態氮含量

參照李華麗[17]的方法。

1.3.6.4 水分含量

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[18]中的直接干燥法。

1.3.6.5 水分活度

將樣品放至室溫后切碎，鋪滿樣品盒底面，注意裝樣量為樣品盒高度的一半。采用HD-4型智能水分活度測量儀測定樣品的水分活度。

1.3.6.6 氯化鈉含量

采用間接滴定法[19]測定酸肉的氯化鈉含量。

1.3.6.7 色差

將樣品切成1 cm厚，用WSC-3B便攜式精密色差儀進行測定，分別測定酸肉切片的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.3.6.8 游離氨基酸含量

儀器分析條件：2619#離子交換色譜柱（4.6 mm×150 mm）；洗脫液流速0.225 mL/min；茚三酮流速0.3 mL/min；柱壓80～130 kg/cm2；茚三酮壓力15～35 kg/cm2；氮氣壓力0.28 kg/cm2；柱溫53 ℃；標準樣品濃度3 nmol/50 μL；每個樣品的分析時間為74 min。以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的含量[20]。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次，結果表示為平均值±標準差。使用Origin 8.6軟件作圖，使用SPSS 17.0軟件對數據進行統計和方差分析（P<0.05），判定數據間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 食鹽添加量的選擇

由圖2可知，對于產酸速率，食鹽添加量為8%時，發酵30 d可以使酸肉的pH值達到（4.76±0.05），產酸速率較為適中，此時酸肉的感官評分最高，為（86.00±1.88） 分。食鹽添加量為4%的酸肉樣品腌制7 d后已腐爛變質，棄去。因此選擇食鹽添加量為6%、8%、10%進行正交試驗。鹽用量對酸肉的pH值影響較大，食鹽用量越少pH值降低越快，表明食鹽對乳酸菌產酸有抑制作用。食鹽能夠降低發酵肉的水分活度，影響微生物的滲透壓[21]，因此鹽濃度的選擇要考慮抑制微生物與防止過度產酸兩方面。

2.1.2 發酵劑接種量的選擇

由圖3可知，隨著發酵劑接種量的增加，酸肉的pH值下降速率變快。接種量為2.0%時，酸肉的pH值降至（4.11±0.03），接種量為3.0%時降至3.9以下。接種量為0.5%～2.0%時，酸肉的感官評分隨接種量增大而升高；接種量大于2.0%之后，由于酸味刺激導致感官評分下降。考慮到酸肉保存時間較長、后期乳酸菌繼續發酵會導致其酸度過高以及生產成本等因素，選擇發酵劑接種量0.5%、1.0%、2.0%進行正交試驗。

2.1.3 糯米飯添加量的選擇

由于肉中碳水化合物較少，按少數民族傳統工藝配方在酸肉中添加糯米飯，其可作為乳酸菌生長分解碳水化合物的底物，也為酸肉提供了獨特的口感和風味。由圖4可知，糯米飯的添加量直接影響著酸肉的pH值和感官品質。糯米飯添加量增加有利于乳酸菌產酸，添加量為35%～45%時，酸肉pH值隨添加量的增大下降明顯，感官評分隨之升高；糯米飯添加量大于45%時，酸肉pH值基本保持不變，這可能是由于在30 d的發酵時間內乳酸菌對碳源的利用率有限，而糯米飯添加量過高會影響酸肉口感，感官評分下降。因此，選擇糯米飯添加量為40%、45%、50%進行正交試驗。

2.1.4 發酵溫度的選擇

由圖5可知，發酵溫度越高，酸肉的pH值越低。5～15 ℃溫度范圍內發酵時，酸肉pH值下降速率加快，15～25 ℃發酵時，酸肉pH值下降較為緩慢。發酵溫度15 ℃，發酵至30 d時，酸肉的pH值達（4.74±0.04），此時感官評分最高，為（81.00±1.67） 分。在能夠達到所需pH值的基礎上，考慮到后期酸肉的繼續發酵及合適的貯藏溫度，結合貴州少數民族地區制作酸肉的季節為秋、冬季，溫度較低，因此選擇發酵溫度為10、15、20 ℃進行正交試驗。

2.2 正交試驗結果

由表3可知：從感官品質來看，酸肉的感官評分越高越好，因此最優水平為A2B3C2D2；從pH值來看，低pH值有利于產品保存，因此最優水平也為A2B3C2D2，即食鹽添加量8%、發酵劑接種量2.0%、糯米飯添加量45%、發酵溫度15 ℃。

由表4可知，食鹽添加量、發酵劑接種量對酸肉的感官評分均影響顯著（P<0.05），4 個因素的影響主次順序為食鹽添加量（A）>發酵劑接種量（B）>糯米飯添加量（C）>發酵溫度（D），說明食鹽添加量的影響作用最大，此結果與李華麗[17]的研究結果一致。發酵劑接種量、發酵溫度對酸肉的pH值均影響顯著（P<0.05），4 個因素的影響主次順序為發酵劑接種量（B）>發酵溫度（D）>食鹽添加量（A）>糯米飯添加量（C），說明乳酸菌的接種量直接影響酸肉的pH值，而乳酸菌在發酵過程中受溫度影響較大。

發酵期間的產酸速率越快，則越能抑制雜菌生長，縮短發酵周期，因此制作酸肉時要在較短的時間內使其pH值快速下降到較低水平，并且要保證產品的酸味柔和、不刺激。根據正交試驗結果，綜合考慮各因素對酸肉感官評分和pH值影響的主次順序和感官評分僅提供參考這一客觀因素，確定酸肉的最佳制作工藝條件為A2B3C2D2，即食鹽添加量8%、發酵劑接種量2%、糯米飯添加量45%、發酵溫度15 ℃。在此條件下進行驗證實驗，酸肉的感官評分為（92.00±1.55） 分，pH值為（4.67±0.08）。

2.3 采用優化工藝制作的酸肉發酵期間的質量指標變化

2.3.1 微生物的動態變化

由圖6可知，酸肉發酵過程中的菌落總數呈先上升后下降的趨勢。發酵0～30 d時，自然發酵組酸肉的菌落總數由（5.29±0.21） （lg（CFU/g））

上升到（7.02±0.24） （lg（CFU/g）），乳酸菌數由（4.81±0.22） （lg（CFU/g））上升到（6.93±0.38） （lg（CFU/g））；接菌組酸肉的菌落總數由（7.93±0.23） （lg（CFU/g））上升到（9.37±0.25） （lg（CFU/g）），乳酸菌數由（6.05±0.18） （lg（CFU/g））上升到（8.73±0.32） （lg（CFU/g））。以上結果表明，酸肉自然發酵過程中主要是乳酸菌屬等厭氧細菌數量增加。但是自然發酵組酸肉發酵60 d后乳酸菌才逐漸形成優勢，乳酸菌數達7.32 （lg（CFU/g）），而接種乳酸菌發酵的酸肉，其乳酸菌數在發酵30 d時就顯著高于自然發酵組發酵60 d的乳酸菌數（P<0.05）。在發酵后期，接菌組和自然發酵組酸肉的乳酸菌數均先緩慢下降，然后維持在一定數量級動態變化，但接菌組酸肉的乳酸菌數依然高于自然發酵組，說明乳酸菌在發酵過程中占據優勢，加快產品成熟，抑制其他腐敗菌和致病菌的生長繁殖，保障產品安全[22]。這與Xanthopulos等[23]報道的乳酸菌在發酵和成熟過程中均保持優勢菌地位，從而控制發酵全過程相一致。

接菌組酸肉經過30 d的發酵后，沒有檢出腸桿菌，而在對照組酸肉中，直到發酵第60天才沒有檢出腸桿菌，接種發酵劑明顯抑制了酸肉中大腸桿菌的生長繁殖。

Fadda等[24]推測快速降低的pH值以及乳酸菌產生的細菌素可能是抑制致病菌的主要原因。

2.3.2 理化指標變化

2.3.2.1 pH值和總酸含量

由圖8可知，2 組酸肉的pH值隨發酵時間的延長均呈下降趨勢，發酵30 d時，自然發酵組酸肉的pH值從起始的（6.41±0.04）下降到（5.59±0.03），而接種乳酸菌組酸肉的pH值從（6.37±0.04）快速降至（4.79±0.02），達到了自然發酵組酸肉發酵60 d的pH值（（4.80±0.02）），下降速率顯著大于自然發酵組，達到了快速產酸的目的。這主要是由于乳酸菌作為發酵劑接種到肉中后，作為絕對優勢菌群分解肉和糯米飯中的碳水化合物，產生乳酸等酸類物質，從而快速降低酸肉的pH值[25]。pH值不僅影響微生物的生長，還對食品中內源酶的活性具有重要意義，是衡量食品風味和口感的重要指標[26]。在整個發酵周期內，接菌組酸肉的pH值均低于自然發酵組。pH值的變化與乳酸菌代謝碳水化合物和蛋白質分解有關[27]，在發酵初期，乳酸菌主要分解碳水化合物產生乳酸，使pH值下降，隨著發酵時間的延長，碳水化合物被消耗，微生物分解蛋白質，產生了一些氨及胺類等堿性含氮物質，使pH值變化減緩。2 組酸肉的總酸含量在發酵過程中呈先增加而后逐漸降低的趨勢，均在發酵90 d時達到最高值，此時自然發酵組和接種乳酸菌組酸肉樣品的總酸含量分別比發酵前增加了3.73 倍和3.88 倍。乳酸含量的增加有利于保持腸道中的合適菌群，并促進鈣的吸收，具有重要的營養意義[28]。

2.3.2.2 水分含量、水分活度和氨基酸態氮含量

酸肉發酵初期，肉塊浸泡在發酵液中，在發酵過程中吸收了部分發酵液。由表5可知，在發酵15 d時，酸肉的水分含量增大，但是隨著發酵的繼續進行，2 組酸肉的水分含量均呈現總體下降的趨勢。接種乳酸菌發酵的酸肉，其水分含量在發酵30 d時就開始顯著低于自然發酵組（P<0.05）。發酵肉制品的發酵過程常常伴隨著水分活度的降低，低水分活度是發酵肉制品貨架期較長和食用安全性較高的原因。

自然發酵酸肉的水分活度下降速率較慢，接種乳酸菌發酵組酸肉的水分活度下降較快，2 組酸肉的水分活度在發酵30 d時出現顯著差異（P<0.05），此時接菌組酸肉的水分活度達到對照組發酵90 d時的水分活度。水分活度降低能夠減少微生物能利用的水分，具有協助提高產品的安全性、抑制雜菌生長的作用[29]。因此，接種2 株乳酸菌發酵酸肉能夠顯著提高產品的保藏性和安全性。

發酵0～120 d內，酸肉的氨基酸態氮含量迅速增加，且接種乳酸菌組酸肉在發酵過程中均顯著高于對照組（P<0.05）。接菌組酸肉的氨基酸態氮含量在發酵30 d時達到（69.02±0.19） mg/100 g，顯著高于對照組發酵90 d的含量值。通常，傳統酸肉的發酵時間為90～180 d，最佳食用時間為發酵180～360 d。本研究結果表明，接種2 株乳酸菌可以使酸肉在發酵30 d即可達到自然發酵90 d的效果。接種2 株乳酸菌發酵后酸肉的氨基酸態氮含量顯著增加，可以提高肉制品的營養價值與風味。

2.3.2.3 氯化鈉含量

由圖9可知，在酸肉的發酵過程中，氯化鈉含量呈上升趨勢。發酵0～180 d內，接種乳酸菌發酵組酸肉的氯化鈉含量從（4.51±0.12）%上升到（4.87±0.11）%，自然發酵組酸肉從（4.49±0.15）%上升到（4.71±0.09）%，這與加工過程中酸肉水分含量的降低有關。雖然發酵初期腌制用食鹽的添加量為8%，但2 組酸肉在發酵過程中的含鹽量均控制在5%以下，顯著低于傳統加工酸肉15%～20%的含鹽量。采用新工藝制作的酸肉鮮、酸、咸適中，更適合大眾的口味，滿足了低鹽的健康需求。

2.3.2.4 色差

由表6可知，2 組樣品在不同發酵時期的L*、a*和b*均差異顯著（P<0.05），發酵后的酸肉顏色鮮紅，外表有光澤。接菌組酸肉的L*、a*在發酵30 d時就顯著高于對照組酸肉發酵60 d時的值，b*顯著低于對照組

（P<0.05），說明乳酸菌的加入對發酵香腸的顏色，特別是L*有很大影響，發色效果較佳。Moler等[30]將發酵乳桿菌JCM1173和IF03956應用于無硝發酵腸生產中，獲得了穩定的腌肉顏色。

2.3.2.5 游離氨基酸含量

游離氨基酸有助于產品風味的改善[31]。由表7可知，接菌組酸肉含有更高濃度的必需氨基酸，相較于發酵1 d時，其在發酵60 d時的賴氨酸含量增加了62.77 mg/100 g，苯丙氨酸含量增加了100.00 mg/100 g，亮氨酸含量增加了108.98 mg/100 g，異亮氨酸含量增加了44.42 mg/100 g，蛋氨酸含量增加了38.86 mg/100 g，纈氨酸含量增加了57.81 mg/100 g，且均顯著高于自然發酵組的增加量（P<0.05），說明接種2 株乳酸菌在一定程度上提高了酸肉的營養價值[32]。與發酵前相比，酸肉的游離氨基酸總量提高了，接菌組酸肉的總游離氨基酸含量在發酵30 d時就接近自然發酵組酸肉發酵60 d時的含量，表明接種的乳酸菌在發酵過程中迅速繁殖。蛋白質在發酵微環境及肌肉蛋白酶的共同作用下降解產生游離氨基酸和多肽[33]，增強產品風味和營養價值，也是進一步產生風味物質的底物[34]。

3 結 論

本研究將彎曲乳桿菌SR6和戊糖片球菌SR4-2混合作為發酵劑進行酸肉發酵，采用單因素試驗及正交試驗對酸肉發酵的工藝條件進行優化，得到優選發酵參數為食鹽添加量8%、發酵劑接種量2.0%、糯米飯添加量45%、發酵溫度15 ℃。在此工藝條件下，酸肉的發酵時間為30 d，比傳統自然發酵縮短了60 d；酸肉的氯化鈉含量控制在4.5%～5.0%之間；水分含量和水分活度在發酵過程中顯著降低；酸肉的氨基酸態氮、總游離氨基酸和必需氨基酸含量明顯升高；L*和a*升高，b*降低，發色效果較佳。因此，將彎曲乳桿菌SR6和戊糖片球菌SR4-2混合發酵劑應用于低鹽型酸肉制作可以快速發酵，并提高產品的質量和安全性，具有較好的應用潛力。

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