膠孢炭疽菌G蛋白α亞基CgGα2的生物學(xué)功能

柯智健　張月鳳　艾瑩飛　李曉宇　柳志強

摘要

G蛋白（G protein/GTP binding protein）是能與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合，具有水解GTP 生成GDP，即具有GTP 酶（GTPase）活性的蛋白。G蛋白在植物病原菌生長發(fā)育及致病過程中發(fā)揮著重要的作用，然而目前還未有關(guān)于膠孢炭疽菌G蛋白生物學(xué)功能的研究。本研究從膠孢炭疽菌中克隆了一個G蛋白α亞基中的基因CgGα2，該基因編碼一個354個氨基酸的蛋白，含有一個G_alpha的功能域。利用同源重組的方法獲得了該基因的敲除突變體，并且在此基礎(chǔ)上得到了突變株的互補株，將兩者與野生型相比，突變體表現(xiàn)為營養(yǎng)生長緩慢，產(chǎn)孢量減少，對NaCl和H2O2更加敏感，對SDS的耐受性增加，對致病力無明顯影響。以上結(jié)果表明，CgGα2參與調(diào)控膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長及分生孢子產(chǎn)生，并可能與該病菌的滲透壓響應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞

膠孢炭疽菌； G蛋白信號途徑； Gα亞基； 營養(yǎng)生長； 分生孢子

中圖分類號：

S432.44

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017150

Biological function of the G protein αsubunit CgGα2 in

Colletotrichum gloeosporioides

KE Zhijian， ZHANG Yuefeng， AI Yingfei， LI Xiaoyu， LIU Zhiqiang

（Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract

G protein， which has the activity of GTPase， is able to bind to guanine nucleotide， and has the ability to hydrolyze GTP to GDP. G protein plays an important role in growth， development and pathogenicity of plant pathogens， but there has been no studies on the biological functions of G protein in Colletotrichum gloeosporioides so far. In this study， one of the G protein αsubunit gene CgGα2 was cloned from C.gloeosporioides. CgGα2 encoded a 354amino acid protein and contained a functional domain of G_alpha. The knockout mutant of CgGα2 was obtained by homologous recombination， and the complementary strain was obtained from the knockout mutant. Compared to the wild type and complementary strain， the knockout mutant of CgGα2 resulted in slow vegetative growth， decreased conidium production， more sensitive to NaCl and H2O2， and more tolerant to SDS.CgGα2 had no effect on the virulence of C.gloeosporioides. These results suggest that CgGα2 is involved in regulating vegetative growth and conidiation， and it might also be involved in osmotic pressure and oxidative stress response of C.gloeosporioides.

Key words

Colletotrichum gloeosporioides； G protein signaling pathway； Gα subunit； vegetative growth； conidium

炭疽菌屬Colletotrichum Corda由Corda于1831年建立，其分類地位在Ainsworth系統(tǒng)中，隸屬于真菌門Eumycota，半知菌亞門Deuteromycotina，腔孢綱Coelomycetes，黑盤孢目Melanconiales，黑盤孢科Melanconiaceae[1]，其廣泛分布于溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)，是引起植物炭疽病害的一類重要的植物病原真菌。炭疽菌通常出現(xiàn)在春季和夏季，主要危害木本植物地上部分的葉片和果實，引起早期落葉、落果[2]。膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides是一種重要的炭疽病菌，該病菌不但寄主范圍廣，而且有各種各樣的侵染策略，目前防治該病菌較為困難[3]。因此，探究該菌在侵染過程中相關(guān)基因的功能對有效防治該病菌具有重要的理論和實踐意義。

G蛋白（G protein/GTP binding protein）能與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合，具有GTP酶（GTPase）活性，可水解GTP生成GDP[4]。 G蛋白是一個超級家族（GTPbinding proteins superfamily），包括膜受體偶聯(lián)的異源三聚體G蛋白（heterotrimeric GTP binding protein）和小G蛋白（Small GTPbinding Proteins）[5]。其中異源三聚體G蛋白是由α、β、γ 3種亞基組成，α亞基單體分子量為39～52 kD，β和γ亞基分子量分別為35～37 kD和6～10 kD；不同的G蛋白由不同的基因編碼，不過β、γ亞基盡管是兩個不同基因的產(chǎn)物，但在自然狀態(tài)下，兩者以非共價緊密結(jié)合，只有在變性條件下才能分開[6]。

異源三聚體G蛋白在真核生物中幾乎都是保守的，它們能夠感知和傳遞胞外信號進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并引發(fā)相應(yīng)的生理和生化應(yīng)答過程[7]。在不同的真菌中G蛋白α亞基存在著多種類型，如稻瘟病菌Magnaporthe oryzae存在著magA、magB、magC三種Gα亞基，香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cubense中也存在著三種Gα亞基，分別為fga1、fga2、fga3。除此之外，包括粗糙脈胞菌Neurospora crassa、小麥赤霉菌Gibberella zeae、構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans等絲狀真菌中也存在著多種不同的Gα亞基。Gα（GTP）亞基是許多效應(yīng)器的激活劑，從其初級結(jié)構(gòu)分析得知，它們具有一致的保守區(qū)和多變區(qū)[8]。目前，Gα亞基在稻瘟病菌M.oryzae[9]、粗糙脈孢菌N. crassa[10]、小麥條銹病菌Puccinia striiformis[11]等病原真菌中得到鑒定，它們在參與調(diào)控營養(yǎng)生長，孢子產(chǎn)生、附著胞形成及致病性等方面發(fā)揮不同的作用。然而目前還未有關(guān)于膠孢炭疽菌G蛋白生物學(xué)功能的研究。在前期研究中，我們從膠孢炭疽菌中鑒定了三種Gα亞基，分別命名為CgGα1、CgGα2和CgGα3，本研究對其中一個Gα亞基CgGα2的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：膠孢炭疽菌C.gloeosporioides野生型菌株（WT）由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉18 g/L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂粉18 g/L。CM培養(yǎng)基：胰蛋白胨6 g/L、酵母提取物6 g/L、蔗糖10 g/L、瓊脂粉18 g/L。Czapek培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L、NaNO3 3 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO41 g/L、FeSO4 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、瓊脂粉18 g/L。MM培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、NaNO3 1 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、瓊脂粉18 g/L。

1.2 CgGα2基因克隆及生物信息學(xué)分析

基因組提取利用CTAB法[12]。提取RNA用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extracton Kit （TaKaRa，中國）試劑盒。利用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa，中國）合成cDNA。以GenBank中草莓膠孢炭疽菌C.gloeosporioides Nara gc5 G protein alpha subunit （XP_007283616）基因的ORF框序列作為參照來設(shè)計引物CgGα2F/CgGα2R（表1），以野生型基因組DNA和cDNA作為模板，利用PCR擴增CgGα2基因的DNA和cDNA序列。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收純化，連接，轉(zhuǎn)化以及酶切鑒定之后送上海生工測序公司測序。利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）工具對CgGα2進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析蛋白的同源性，利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法（Neighborjoining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 CgGα2基因的敲除及突變體的鑒定

以野生型基因組DNA作為模板，分別以CgCα2upF和CgCα2upR，CgCα2downF和CgCα2downR（表1）作為引物擴增CgGα2基因的上下游片段。將上下游片段通過酶切回收后，與載體pCB1532（含氯嘧磺隆抗性基因Sur）連接，獲得敲除載體pCB1532CgGα2。圖1為CgGα2基因同源置換的原理。將敲除載體通過BamH Ⅰ酶切線性化，轉(zhuǎn)化到膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的野生型菌株的原生質(zhì)體中，原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化的方法參照Liu等[13]。轉(zhuǎn)化子在含有100 μg/mL氯嘧磺隆抗性標(biāo)記的平板上篩選。提取抗性轉(zhuǎn)化子的基因組。以CgGα2基因上游序列的上翼序列和下游序列的下翼序列分別設(shè)計引物CgGα2UU和CgGα2DD（表1），隨后以pCB1532上靠近上游和下游的片段，分別設(shè)計引物PI和PI1（表1）。利用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1，CgGα2F和CgGα2R這三對引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。使用CgGα2F和CgGα2R引物擴增后，無擴增條帶，而使用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1引物擴增后出現(xiàn)目的條帶的轉(zhuǎn)化子為基因敲除突變體。

以野生型菌株的基因組DNA作為PCR擴增的模板，以CgGα2hbF和CgGα2hbR作為引物擴增CgGα2基因的互補片段，將其與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的DNA片段相連，然后連接到pUC18質(zhì)粒上，得到互補載體pUC18CgGα2。將載體轉(zhuǎn)化到CgGα2敲除突變體制備的原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化方法如上所述。將轉(zhuǎn)化子在含有潮霉素（300 μg/mL）的平板上篩選。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以CgGα2F 和CgGα2R作為引物，進(jìn)行PCR驗證，能擴增出CgGα2基因片段的為互補轉(zhuǎn)化子。

1.4 營養(yǎng)生長測定

使用0.5 cm直徑的打孔器在野生型菌株、敲除突變體和互補株的菌落邊緣打取菌餅，分別接種到PDA、CM、MM、Czapek平板上，28℃培養(yǎng)7 d，量取菌落直徑并拍照，試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.5 產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率測定

取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的野生型菌株、敲除突變體和互補株的平板，利用涂布棒刮去菌絲，在28℃下光照培養(yǎng)4 d，誘導(dǎo)其產(chǎn)生分生孢子。向培養(yǎng)基中加入10 mL含有2%吐溫80的無菌水沖洗孢子，然后利用脫脂棉過濾孢子液，使用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。將40 μL野生型、敲除突變體和互補株的孢子懸浮液滴在滅菌的玻璃載玻片上，28℃培養(yǎng)4 h后，在顯微鏡下觀察，計算孢子萌發(fā)率，培養(yǎng)8 h后，計算附著胞形成率。試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.6 脅迫因子敏感性分析

野生型菌株、敲除突變體和互補株在PDA上生長7 d后，利用打孔器打取0.5 cm的菌餅，分別接種在含有NaCl （0.5、0.8、1 mol/L），H2O2（10、20、30 mmol/L），SDS （0.01%，0.02%，0.03%）的MM平板上，在28℃下培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，計算其抑制率，抑制率=（對照組菌落直徑試驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.7 致病性試驗

挑選生長健康的芒果，用70%的乙醇對芒果表面進(jìn)行消毒。將處理后的芒果放置在保鮮盒中，保鮮盒底部用雙層濕潤的濾紙保濕。使用0.5 cm直徑的打孔器在野生型菌株、敲除突變體和互補株菌株的邊緣打取菌餅。分別以無傷口和有傷口的方式接種在芒果上，6 d后觀察致病情況。試驗重復(fù)3次，每次試驗設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CgGα2基因克隆及生物信息學(xué)分析

以膠孢炭疽菌野生型菌株的cDNA作為模板，利用PCR技術(shù)擴增CgGα2基因cDNA片段。測序結(jié)果表明，CgGα2基因編碼354個氨基酸。通過SMART工具分析發(fā)現(xiàn)其含有一個G_alpha的功能域 （圖2a）。CgGα2蛋白在炭疽菌屬內(nèi)相對保守，與C.chlorophyti （OLN85919），C.higginsianum （XP_018155894） 中同源蛋白的相似度都在90%以上，同時發(fā)現(xiàn)其與粗糙脈胞菌N.crassa （AAD01207） 中同源蛋白有著77%的相似度，與大豆疫霉Phytophthora sojae （XP_009515731） 和小麥條銹病菌P. striiformis f.sp. tritici （KNE88994） 相關(guān)同源蛋白也有著40%～50%的同源性。CgGα2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2b。

2.2 CgGα2基因的敲除及驗證

為了明確CgGα2基因的生物學(xué)功能，本研究組構(gòu)建了pCB1532CgGα2載體，利用限制性內(nèi)切酶線性化之后導(dǎo)入野生型的原生質(zhì)體中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，共得到了112個具有氯嘧磺隆抗性的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，分別用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1，CgGα2F和CgGα2R為引物進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果顯示102號轉(zhuǎn)化子以CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1為引物時可擴增出1 500 bp左右的目的條帶，而以CgGα2F和CgGα2R作為引物時無擴增條帶（圖3）。因此確定102號轉(zhuǎn)化子為敲除突變體，命名為ΔCgGα2102。

將構(gòu)建的互補載體pUC18CgGα2轉(zhuǎn)化到敲除突變體ΔCgGα2102的原生質(zhì)體中，在含有潮霉素的平板上篩選，得到24個抗性轉(zhuǎn)化子，通過PCR驗證，發(fā)現(xiàn)4號轉(zhuǎn)化子能夠擴增出CgGα2基因片段（圖3），因此確定其為互補轉(zhuǎn)化子，將其命名為ΔCgGα2/gα2。

2.3 營養(yǎng)生長

將野生型、ΔCgGα2102和ΔCgGα2/gα2菌株分別接種到PDA、MM、CM和Czapek培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d觀察其生長情況。如圖4所顯示，突變體ΔCgGα2102在以上4種培養(yǎng)基上生長緩慢。尤其是在營養(yǎng)更為貧瘠的Czapek和MM培養(yǎng)基上，突變體的生長速率顯著降低。由此可見CgGα2參與調(diào)控膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長。

2.4 產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率

通過上述方法測定產(chǎn)孢量。結(jié)果如表2顯示，ΔCgGα2102的產(chǎn)孢量與野生型和互補株存在著顯著差異。野生型的產(chǎn)孢量平均為3.57×106個/mL，互補株為3.38×106個/mL 而ΔCgGα2102的產(chǎn)孢量平均為2.10×105個/mL，僅為野生型的1/17。ΔCgGα2102的孢子萌發(fā)率以及附著胞形成率與野生型無顯著差異。由此可見，CgGα2參與調(diào)節(jié)了分生孢子的產(chǎn)量。

2.5 脅迫因子的影響

測試了不同脅迫因子對于突變體ΔCgGα2102生長的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5a可以看出，隨濃度的增加，NaCl對突變體ΔCgGα2102的抑制率始終要大于野生型和互補株。在含H2O2的MM培養(yǎng)基上， 敲除突變體ΔCgGα2102對H2O2更加敏感，抑制率顯著大于野生型菌株和互補株ΔCgGα2/gα2；在含SDS的培養(yǎng)基上，突變體ΔCgGα2102對SDS較野生型和互補株ΔCgGα2/gα2有較大的耐受性，且隨著SDS濃度的增大，突變體ΔCgGα2102的耐受性始終大于野生型和互補株ΔCgGα2/gα2。

2.6 致病性

將野生型、突變體ΔCgGα2102和互補株ΔCgGα2/gα2的菌餅接種于芒果上，保濕培養(yǎng)6 d，致病情況如圖6所示。從圖中可以看出，無論是有傷口接種還是無傷口接種，突變體ΔCgGα2102所造成的病斑大小都和野生型及互補株ΔCgGα2/gα2的差異不大。因此，CgGα2并不影響膠孢炭疽菌的致病力。

3 討論

G蛋白偶聯(lián)的信號傳遞通路是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要途徑，通過跨膜受體識別胞外信號并將其轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)應(yīng)答，其中G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體形成了最大的信號家族[14]。Gα亞基是一種功能亞基，不同的Gα亞基就構(gòu)成了不同的G蛋白。研究發(fā)現(xiàn)真菌中存在著多個Gα亞基，參與調(diào)控營養(yǎng)生長、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)、附著胞形成、滲透壓響應(yīng)、致病性等多個方面。本研究通過同源置換成功獲得CgGα2敲除突變體，表型分析發(fā)現(xiàn)突變體的營養(yǎng)生長減緩，但在不同的培養(yǎng)基上其生長速率不同，這可能與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關(guān)。相對于PDA和CM，Czapek和MM培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分相對匱乏，使突變體的營養(yǎng)生長缺陷表現(xiàn)得更為明顯。同時突變體的產(chǎn)孢量減少，但其孢子萌發(fā)和附著胞形成卻沒有受到影響，說明了CgGα2基因僅僅參與調(diào)控膠孢炭疽菌C.gloeosporioides分生孢子產(chǎn)生，而并不影響其萌發(fā)過程。在脅迫試驗中，突變體對于NaCl和H2O2都更加敏感，而且突變體對于SDS的耐受性要強于野生型，這說明CgGα2基因參與調(diào)控了滲透壓響應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。在致病性試驗中，突變體可以使芒果致病，病斑和野生型無明顯差異，說明了CgGα2基因并不影響其致病性。

研究發(fā)現(xiàn)，Gα亞基在不同真菌中起到了不同的作用。在稻瘟病菌M.oryzae中，Gα亞基影響其營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、附著胞的分化以及致病性；其中CgGα2同源蛋白magC參與了稻瘟病菌的產(chǎn)孢，但不影響附著胞萌發(fā)，在這點上和CgGα2的功能是一致的，但magC蛋白卻并不影響稻瘟病菌的營養(yǎng)生長[9]。bcg2亞基是灰葡萄球菌Botrytis cinerea的一個Gα亞基，其被敲除后，菌落形態(tài)無明顯變化，但致病性降低[15]。在粗糙脈胞菌N. rassa中Gα亞基影響了分生孢子的產(chǎn)生和胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的水平[10]；在草酸青霉Penicillium oxalicum中，Gα亞基缺失突變體在以葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落變小，顏色變深的現(xiàn)象[16]；在玉米大斑病菌Setosphaeria turcica中，Gα亞基缺失后，會出現(xiàn)菌落低矮，氣生菌絲稠密等表型[17]。

Gα亞基所在的G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是生物體中重要的信號感應(yīng)和應(yīng)答系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由G蛋白偶聯(lián)受體（G proteincoupled receptors，GPCRs）、異源三聚體G蛋白、下游效應(yīng)分子以及信號調(diào)控蛋白組成[18]。目前已知在膠孢炭疽菌存在8個GPCR蛋白，其中碳源感應(yīng)因子類有3個；類cAMP受體類有2個，信息素受體、氮源感應(yīng)因子和真菌視蛋白類各1個[19]。活化的G蛋白通過下游效應(yīng)分子進(jìn)行信號傳遞，這一過程主要包含3條信號通路：cAMPPKA 途徑、MAP （mitogenactivated protein）激酶途徑和IP3Ca2+/DAGPKC途徑[20]。CgPKAC基因位于cAMPPKA途徑上，當(dāng)該基因缺失時，附著胞形成被延遲，疏水表面的附著能力減弱，致病性也減弱[21]。RGS蛋白對G蛋白信號傳導(dǎo)途徑起到了負(fù)調(diào)控作用。已報道的膠孢炭疽菌C.gloeosporioides CgRGS2和CgRGS4蛋白，參與調(diào)控膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的營養(yǎng)生長，分生孢子產(chǎn)量及萌發(fā)，氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞壁完整性，以及致病性[2223]。而本文所研究的CgGα2基因雖然并不影響膠孢炭疽菌的致病性，但參與調(diào)控了營養(yǎng)生長和分生孢子產(chǎn)量?？偟膩碚f，目前關(guān)于膠孢炭疽菌C.gloeosporioides G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究還處于起步階段，也未有關(guān)于G蛋白α亞基相關(guān)功能的報道，本研究對于深入解析膠孢炭疽菌C.gloeosporioides G蛋白的調(diào)控機制奠定了一定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）