玉米根際球孢白僵菌群體遺傳多樣性的ISSR分析

齊永霞　陳方新

摘要

為了明確玉米根際球孢白僵菌的遺傳分化情況及親緣關(guān)系，通過ISSRPCR分子標記技術(shù)對分離自玉米根際的球孢白僵菌的遺傳多樣性進行了研究。從40個引物中共篩選出11個多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物用于正式的擴增分析，在37個菌株中共擴增出83條譜帶，其中多態(tài)性條帶占69條，多態(tài)性百分率為83.13%。平均每引物擴增條帶在7.5條。群體的多態(tài)位點百分率（PPL）為83.13%，Nei基因多樣性指數(shù)（H）為0.316 9，Shannon信息指數(shù)（I）為0.465 7。結(jié)果表明，分離自安徽省渦陽、蕭縣、蒙城三個地區(qū)的球孢白僵菌具有較高的遺傳多樣性。研究結(jié)果對進一步探討玉米根際球孢白僵菌不同菌株的生防效果具有重要意義。

關(guān)鍵詞

球孢白僵菌； 分子標記； 遺傳分化； 遺傳多樣性

中圖分類號：

S 476.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017184

Genetic diversity of Beauveria bassiana in maize rhizosphere by

intersimple sequence repeat （ISSR） markers

QI Yongxia， CHEN Fangxin

（College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract

To identify the genetic differentiation and genetic relationships among the isolates of Beauveria bassiana from maize rhizosphere， the genetic diversity of 37 B.bassiana strains was estimated by using intersimple sequence repeats （ISSR） markers. Eleven of 40 ISSR primers were chosen for analysis of their reproducibility and high polymorphism. Each primer resulted in 7.5 markers and totally 83 fragments were amplified， in which 69 （83.13%） were polymorphic. Genetic diversity analysis revealed a relatively high level of intraspecific genetic diversity of B.bassiana. The percentage of polymorphic loci （PPL） was 83.13%； Neis genetic diversity （H） was 0.316 9 and Shannons information index （I） was 0.465 7. It suggested that the 37 B.bassiana strains isolated from Guoyang， Xiaoxian and Mengcheng had high genetic diversity. The results were of great significance for further studying the biological control effect of B.bassiana strains.

Key words

Beauveria bassiana； molecular marker； genetic differentiation； genetic diversity

白僵菌Beauveria sp.是重要的生物防治資源，據(jù)報道，白僵菌可用于防治農(nóng)、林、衛(wèi)生等多種害蟲，均取得良好的效果[13]。球孢白僵菌B.bassiana是白僵菌屬中最著名的種，其在自然界的寄主范圍廣泛，可侵染15目149科700多種昆蟲，是極有利用價值的蟲生真菌[47]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，人們已經(jīng)開始利用分子生物學(xué)的研究技術(shù)對蟲生真菌的遺傳多樣性進行研究，從而彌補了形態(tài)和培養(yǎng)性狀高度變異給傳統(tǒng)分類方法帶來的困擾，給種下菌株的親緣關(guān)系鑒定提供了可靠的依據(jù)，有助于加強對蟲生真菌遺傳多樣性的研究，并為釋放菌株的檢測和追蹤提供可靠的依據(jù)。

迄今為止，已有多種DNA分子標記技術(shù)用于白僵菌的群體遺傳多樣性研究。丁德貴等[8]利用酯酶同工酶研究了球孢白僵菌種群在松林中的寄主轉(zhuǎn)移及遺傳多樣性對松毛蟲持續(xù)控制的影響，分析結(jié)果表明松林中球孢白僵菌呈現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。方志剛等[9]、林華峰等[10]采用RAPD技術(shù)分析了球孢白僵菌菌株的遺傳分化，發(fā)現(xiàn)菌株間具有較豐富的遺傳多態(tài)性，且菌株DNA多態(tài)性與采集地之間有一定的相關(guān)性。陳名君等[11]利用28S rDNAⅠ型內(nèi)含子技術(shù)研究了瑯琊山球孢白僵菌菌株的遺傳多樣性，結(jié)果顯示同一地區(qū)的菌株在固定時間內(nèi)有較豐富的菌株類型，種群的遺傳結(jié)構(gòu)多樣化。ISSR（intersimple sequence repeats，簡稱ISSR）技術(shù)是一種新型的分子標記，在真菌的遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用[12]。該技術(shù)依據(jù)SSR廣泛存在于真核基因組中，利用基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計引物，對SSR之間的序列進行擴增，其擴增的引物長度為16～18個堿基，引物通常由1～4個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個非重復(fù)的錨定堿基組成，不需要預(yù)先克隆和測序[1315]。與RAPD和AFLP等分子標記相比，由于其引物序列較長，退火溫度高，DNA用量小、安全性較高，可以快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態(tài)性，而且操作簡單、成本較低，具有更高的重復(fù)性，是一種非常理想的檢測種內(nèi)遺傳變異的分子標記[1617]。李旻等[18]應(yīng)用ISSR分子標記技術(shù)研究了安徽省大別山區(qū)不同海拔高度和不同時間段采集到的球孢白

僵菌的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)安徽省大別山區(qū)球孢白僵菌存在較高的遺傳多樣性，其中，種群間遺傳變異相對較小，種群內(nèi)表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化。胡曉磊等[19]用ISSR技術(shù)分析了中國南方球孢白僵菌的遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示中國南方球孢白僵菌的遺傳多樣性水平較高，且種群異質(zhì)性較強。

研究表明，球孢白僵菌廣泛分布于不同的生態(tài)環(huán)境中，其中包括植物根際和組織[2021]。玉米是安徽省重要的糧、飼作物，其在生長過程中經(jīng)常遭受地下害蟲及土傳病害的危害，為了了解球孢白僵菌在玉米根際的分布情況，作者從安徽省渦陽縣、蕭縣和蒙城縣3個玉米種植區(qū)廣泛采集根際土樣，通過稀釋分離法共分離獲得37個球孢白僵菌菌株[22]。本文采用ISSRPCR技術(shù)，旨在從分子水平上探明來自不同地區(qū)的玉米根際球孢白僵菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，探討球孢白僵菌菌株DNA圖譜與菌株的地理來源之間的相關(guān)性，為進一步研究37個菌株對玉米地下害蟲及土傳病害的生物防治效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的37個球孢白僵菌菌株從安徽省渦陽縣、蕭縣、蒙城縣采集的玉米根際土壤中分離獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)方法結(jié)合rDNA ITS鑒定為球孢白僵菌，其中渦陽縣22株，編號為GY1～GY4、GY6～GY20、GY22、GY23、GY25；蒙城縣9株，編號為MC2，MC7～MC14；蕭縣6株，編號為XX1、XX3、XX5、XX6、XX12、XX13。

SDAY培養(yǎng)基[23]：酵母浸出粉10 g；蛋白胨10 g；葡萄糖40 g；瓊脂15 g；水1 000 mL。

Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；dNTPs、DNA marker等購于上海生工生物工程股份有限公司。40個ISSR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 球孢白僵菌菌絲體制備

將供試菌株制成孢子懸浮液，取0.2 mL轉(zhuǎn)接于鋪有玻璃紙的SDAY培養(yǎng)基平板上，倒置于恒溫光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)4～6 d，將長滿全皿而未大量產(chǎn)孢的菌絲體在無菌條件下取出，置于5 mL的滅菌離心管中，經(jīng)冷凍干燥后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 球孢白僵菌基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[24]提取球孢白僵菌基因組DNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。用Eppendorf分光光度計測得濃度后將樣品濃度稀釋到50 ng/μL備用。

1.4 球孢白僵菌的ISSR分析

1.4.1 引物的篩選

為了得到有效的ISSR分子標記，對合成的40條ISSR引物進行了前期預(yù)篩選試驗。以GY1～GY6、MC2、MC6、XX1和XX3共10個菌株的DNA為模板，在25 μL反應(yīng)體系中進行引物擴增效果及可重復(fù)性檢測。最終從40條引物中選出11條擴增條帶清晰、重復(fù)性好及多態(tài)性高的ISSR引物用于37個菌株的PCR擴增，引物編號及序列見表1。

1.4.2 ISSRPCR分析

ISSRPCR擴增反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：超純水（ddH2O）19.5 μL，10×Buffer緩沖液（含Mg2+） 2.5 μL，dNTPs（濃度2.5 mmol/L）1.25 μL，引物（濃度10 μmol/L）0.1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，50 ng/μL模板DNA 0.5 μL。

ISSRPCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，復(fù)性溫度復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

每個引物重復(fù)試驗3次，每次反應(yīng)均設(shè)不加模板的空白對照。擴增結(jié)果用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將ISSR電泳膠圖進行人工讀帶，每條擴增片段計作1個多態(tài)性位點。ISSR是顯性標記，每個樣品的擴增帶按照有或無記錄，有帶記為1，無帶記為0。將DNA凝膠電泳圖譜轉(zhuǎn)換為數(shù)字矩陣。通過NTSYSpc 2.1生物軟件進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建各菌株的親緣關(guān)系樹狀圖，利用POPGEN 32軟件對全部種群和各單個種群分別進行遺傳參數(shù)分析，分別計算觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei（1973）基因多樣性指數(shù)（He）、Shannon信息多樣性指數(shù)（I）、多態(tài)位點百分率（PPL）、群體內(nèi)基因多樣性（Hs）、群體總基因多樣度（Ht）、群體間的遺傳分化系數(shù)（Gst）、Nei（1978）遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌ISSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

通過預(yù)試驗，對40條ISSR引物進行篩選，調(diào)整確定不同引物的退火溫度，最終篩選出擴增條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定，多態(tài)性好的11條引物對37個球孢白僵菌菌株進行多態(tài)性檢測。由表2可以看出，這11個引物均能從供試的37個菌株中擴增出清晰明亮條帶，條帶分布合理。不同引物共擴增出83條譜帶，其中多態(tài)性譜帶為69條，多態(tài)性百分率為83.13%。引物P59（（AG）8YC）擴增出的條帶最多，條帶數(shù)為12條，多態(tài)性條帶為10條，多態(tài)位點比率為83.33%。引物P6、P11、UBC813和UBC825擴增條帶的多態(tài)性位點比例最高，均為100%。引物UBC813（（CT）8A）擴增出的條帶數(shù)最少，只有2條。平均每個引物擴增的條帶數(shù)為7.5條。結(jié)果表明，11個引物都具有一定的標記多態(tài)性，ISSR標記能產(chǎn)生各自有效的多態(tài)性條帶，但多態(tài)性水平各不相同。為了分析地理來源對球孢白僵菌遺傳多樣性的影響，供試菌株選自安徽省渦陽縣、蕭縣和蒙城縣三個不同的地區(qū)，ISSR標記結(jié)果顯示安徽省玉米根際球孢白僵菌存在豐富的遺傳多樣性，但所測試的11個引物中沒有能反映菌株與地理來源有特異性宗譜的特異引物。引物P59和UBC834的ISSR圖譜見圖1。

2.2 球孢白僵菌遺傳多樣性與群體遺傳變異

對采自安徽省不同地區(qū)的37個菌株的群體遺傳多樣性研究結(jié)果表明：在物種總體水平上，球孢白僵菌具有很高的多態(tài)位點百分率（PPL），PPL=83.13%（表3），平均每個位點的有效等位基因數(shù)Ne=（1.558 9±0.364 6），Nei基因多樣性指數(shù)He=（0.316 9±0.183 0），Shannon信息指數(shù)I=（0.465 7±0.250 9）。在種群水平上，各種群的多態(tài)位點百分率差異較大，其中渦陽白僵菌種群的多態(tài)位點百分率（PPL）為81.93%，Nei基因多樣性指數(shù)（He）為0.319 7，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.467 4；而蒙城白僵菌種群的多態(tài)位點百分率（PPL）為68.67%，Nei基因多樣性指數(shù)（He）為0.288 1，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.415 3；蕭縣白僵菌種群的多態(tài)位點百分率（PPL）為39.76%，Nei基因多樣性指數(shù)（He）為0.168 6，Shannon信息多樣性指數(shù)（I）為0.242 8。

2.3 球孢白僵菌種群遺傳分化程度的比較分析

用POPGENE 32計算出的遺傳變異結(jié)果表明（表4）：白僵菌各種群間存在一定的遺傳分化，3個種群總的遺傳多樣性為0.301 1，其中種群內(nèi)遺傳多樣性為0.258 8，Nei基因分化系數(shù)為0.140 4，表明有14.04%的遺傳變異存在于種群間，有85.96%的遺傳變異存在于種群內(nèi)，種群內(nèi)的遺傳分化大于種群間的分化。種群間的基因流為1.530 8。由表3～5可以看出，三個不同種群間的基因流動及其所引起的基因分化差異較大，其中渦陽縣與蒙城縣的基因流最大（4.563 7），基因分化系數(shù)最?。?.051 9），而兩采樣點的地理位置距離為44 km。蒙城縣與蕭縣的基因流最?。?.237 1），基因分化系數(shù)最大（0.168 1），兩采樣點的地理位置距離為133 km。渦陽縣與蕭縣的基因流為1.889 7，基因分化系數(shù)為0.116 8，兩采樣點的地理位置距離為84 km。表明遺傳分化系數(shù)與地理位置沒有一定的相關(guān)性。

2.4 不同地理區(qū)域白僵菌種群的遺傳距離和遺傳一致度

利用POPGENE 32軟件對渦陽縣、蕭縣和蒙城縣3個種群兩兩種群間的Nei遺傳一致度（I）和標準遺傳距離（D）進行分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間的遺傳距離（D）在0.048 8～0.124 4之間，平均為0.085 8；遺傳一致度（I）在0.883 0～0.952 4之間，平均為0.918 1（表3～6）。其中，渦陽、蒙城之間的遺傳一致度最高（0.952 4），遺傳距離最近（0.048 8）；蒙城與蕭縣之間的遺傳一致度最低（0.883 0），遺傳距離最遠（0.124 4）。

2.5 聚類分析

根據(jù)供試菌株ISSRPCR 擴增條帶的有無，以0，1記數(shù)，統(tǒng)計穩(wěn)定、清晰出現(xiàn)的條帶，根據(jù)個體間的相似系數(shù)，采用NTSYSPC軟件對數(shù)據(jù)進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建37個球孢白僵菌菌株的遺傳親緣關(guān)系圖譜。

從ISSR聚類圖（圖2）可以看出，37個供試菌株在SM相似系數(shù)為0.64時聚在一起，在相似系數(shù)為0.72時明顯聚成四大類群：第一大類群（I類）包含GY1、GY2、GY18、GY11、GY4、XX1、XX12、GY16、GY7、GY12、GY19、GY14、MC14、GY22、GY23、MC13、XX3、MC11、GY15、GY17、XX5、GY25、XX6、MC2、MC10和XX13共26個菌株；第二大類群（II類）包含GY3、GY6、GY8和MC74個菌株；第三大類群（III類）是GY10、MC12、GY13、MC8和MC9 5個菌株；第四大類群（IV類）是GY9和GY20 2個菌株。其中，GY14和MC14菌株親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)達到0.95。圖2還可以看出，37個供試菌株并沒有按照地理種群各自聚在一起，這進一步說明了種群間存在較少的遺傳變異。

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標記與RAPD和AFLP等分子標記相比，由于其引物序列較長，退火溫度高，具有更高的重復(fù)性，且操作簡便，是一種理想的檢測種內(nèi)遺傳變異的分子標記[2530]。但對于ISSR分子標記來說，不同引物的退火溫度對試驗結(jié)果的影響較大。退火溫度過低，擴增特異性差，雜帶較多，背景深；退火溫度過高，引物與模板結(jié)合差，電泳條帶弱，甚至沒有擴增。在進行0/1矩陣統(tǒng)計時無法區(qū)分是否是雜帶，或電泳條帶弱，肉眼很難判斷而導(dǎo)致一些有用位點被舍棄，雜帶計入較多，直接導(dǎo)致試驗結(jié)果的偏差，從而導(dǎo)致前期結(jié)果的偏差。本研究通過前期試驗，調(diào)整了部分引物的退火溫度。但本試驗未研究分析其他因素例如儀器型號、反應(yīng)體積等可能對擴增產(chǎn)物的影響。

作者通過預(yù)擴增試驗從40個引物中篩選出擴增結(jié)果穩(wěn)定，多態(tài)性好的11個引物對37個球孢白僵菌菌株進行了多態(tài)性擴增，分析擴增圖譜發(fā)現(xiàn)，ISSR引物表現(xiàn)出很高的遺傳多態(tài)性，多態(tài)性譜帶達到了83.13%，并且擴增結(jié)果均具有很好的重復(fù)性。因此，ISSR分子標記是研究白僵菌等蟲生真菌遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)等的有效方法。

采用POPGENE 32軟件對采自安徽省不同地區(qū)的37個菌株的群體遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果顯示從安徽省3個不同地區(qū)分離的球孢白僵菌的遺傳多樣性水平較高，多態(tài)位點百分率（PPL）達到83.13%，Nei基因多樣性指數(shù)為0.316 9，Shannon信息指數(shù)為0.465 7。遺傳變異結(jié)果表明白僵菌各種群間存在一定的遺傳分化，3個種群總的遺傳多樣性為0.301 1，其中種群內(nèi)遺傳多樣性為0.258 8，Nei基因分化系數(shù)為0.140 4。采用NTSYSPC軟件，根據(jù)個體間的遺傳距離構(gòu)建出37個球孢白僵菌菌株的遺傳親緣關(guān)系圖譜，結(jié)果顯示37個供試菌株并沒有按照地理種群各自聚在一起，聚類組的劃分與地理來源無直接的相關(guān)性，這進一步說明了種群間存在較少的遺傳變異，分析其原因可能是供試的37個球孢白僵菌菌株均分離自玉米根際土壤，而存在于根際土壤中的球孢白僵菌會受到土壤中復(fù)雜環(huán)境因素的影響，為了適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境變化可能發(fā)生變異。本研究結(jié)果顯示渦陽種群涉及所有類群，表明該種群的遺傳異質(zhì)性最高；其次是蒙城種群，不涉及第Ⅲ類群；而蕭縣種群的遺傳異質(zhì)性最低，所有7個菌株全部聚在第Ⅰ大類中。

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（責(zé)任編輯：田 喆）