溫度脅迫下煙粉虱MED隱種與亞洲Ⅱ3隱種三個抗寒基因表達模式的分析

申曉娜　呂志創　李有志　劉萬學　萬方浩

摘要

煙粉虱Bemisia tabaci具有強的溫度耐受性，但煙粉虱入侵種MED隱種與本地種亞洲Ⅱ3隱種在我國的地理分布上存在巨大的差異。因此本研究以煙粉虱MED隱種和亞洲Ⅱ3隱種為研究對象，采用qRTPCR技術分別檢測兩種煙粉虱3個抗寒基因（erythrocyte binding protein， trehalase，dopadecarboxylase）在5個梯度溫度脅迫下mRNA水平上的相對表達量，分析其在高低溫脅迫過程中表達量的變化，探索抗寒基因在煙粉虱MED隱種成功入侵并廣泛分布于各氣候區域中所起的作用。研究結果表明這兩種煙粉虱隱種體內，3個抗寒基因均顯著受低溫誘導。但相對于AsiaⅡ3隱種，低溫脅迫下煙粉虱MED隱種體內的3種抗寒基因能更快速地做出響應，且基因上調或下調的量也相對較多。

關鍵詞

煙粉虱； 溫度脅迫； 抗寒基因； qRTPCR； 定量表達

中圖分類號：

S 433.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017189

Comparative analysis of the expression patterns of three coldresistant gene in

MED and Asia Ⅱ3 cryptic species of Bemisia tabaci under temperature stress

SHEN Xiaona1，2， L Zhichuang2， LI Youzhi1， LIU Wanxue2， WAN Fanghao2

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；

2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Bemisia tabaci has strong temperature tolerance （heat resistance and cold resistance）. However， there were significant differences in the distribution of invasive species （MED cryptic species） and native species （Asia Ⅱ 3 cryptic species） in China. Therefore， in this study， we used qRTPCR to detect the mRNA relative expression level of 3 important coldresistant genes encoding the erythrocyte binding protein， trehalase and dopadecarboxylase in the two B.tabaci cryptic species under the stress of five gradient temperatures. The purpose of the study is to explore the roles of coldresistant genes in the successful invasion of B.tabaci MED cryptic species and widespread distribution in different climatic regions by analyzing the change of the relative expression level. The results of qPCR test showed that three coldresistant genes were significantly induced by low temperature in the two B.tabaci cryptic species. Compared with the Asia Ⅱ 3 cryptic species， B.tabaci MED could make adjustments to adapt to the lowtemperature environment more quickly， and the adjustment level was also relatively higher. Therefore， we speculate that it may be one of the important mechanisms that makes MED cryptic species invade into a wide range of cold regions and adapt quickly to survive.

Key words

Bemisia tabaci； temperature stress； coldresistance gene； qRTPCR； quantitative expression

煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）屬半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一個包含 36 個以上隱種的物種復合體[14]，其中煙粉虱 MED （Mediterranean）（Q型）隱種起源于地中海，入侵性強，隨著世界范圍內的貿易往來，該隱種借助花卉及其他經濟作物的苗木迅速擴散，在世界各地廣泛傳播并暴發成災。2003 年，在中國云南昆明首次發現煙粉虱 MED 隱種[5]，現幾乎分布于全國各個省市[3]，包括位于我國東北嚴寒地區的諸多省市。而亞洲Ⅱ3隱種在我國自然分布的區域要相對小很多，目前仍然僅分布在廣東、臺灣、浙江、湖南、湖北[67]，且沒有向其他地域擴散的趨勢。因此，我們推測煙粉虱的抗寒能力是導致它們分布不同的重要原因之一，本研究通過測定抗寒基因在溫度脅迫下表達量的差異來探索抗寒能力對入侵種和本地種煙粉虱分布的影響。

昆蟲抗寒性物質包括兩類， 即小分子的物質和抗凍蛋白（antifreeze proteins， AFPs）。目前已知的小分子抗寒性物質有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇（可能是阿拉伯糖醇或核酸醇）、海藻糖、葡萄糖、果糖以及某些昆蟲體內的氨基酸和脂肪酸。不同昆蟲積累的物質種類和含量是不同的， 但大多數昆蟲都由幾種抗寒物質構成一個物質系統[8]。其中海藻糖作為昆蟲的血糖，具有對熱、冷、營養缺乏、缺水、氧化試劑等多種不良刺激的耐受性[910]，能夠保護生物膜的完整性和維持生物活性，從而保護細胞免受凍傷[11]。Ueno 等[12]研究發現果蠅在遇到寒冷環境時，代謝率會提高，并且多巴胺含量有變化，表明多巴胺對果蠅行為變化的影響具有溫度敏感性。而erythrocyte binding protein富含多種氨基酸，可作為氨基酸的代表對昆蟲抗寒性進行研究。此外在異色瓢蟲體內也對這些小分子物質進行了初步的研究，研究結果表明這三種物質確實在異色瓢蟲抵御寒冷環境中起到作用[13]。

為了更好地理解煙粉虱的溫度抗逆能力，本試驗從微觀層面找到煙粉虱這三個具有代表性的抗寒關鍵基因，采用qRTPCR技術分別檢測煙粉虱MED隱種和亞洲Ⅱ3隱種兩個種型體內3個重要抗寒基因在短時高低溫脅迫下mRNA水平上的相對表達量，有研究顯示在低于-5℃和高于45℃的溫度脅迫條件下，兩種煙粉虱存活率開始顯著降低，即在-5～45℃的溫度脅迫下這兩種煙粉虱均能正常存活，尚未達到其極端致死溫度[14]，因此本試驗選擇0、12、35、40℃4個溫度梯度對其進行脅迫處理，26℃下做相同處理作為對照。分析其在抵御溫度脅迫時所起的作用，以及對比兩種煙粉虱體內表達量的差異，探索煙粉虱MED隱種成功入侵的原因。期望為進一步研究煙粉虱的溫度適應機制和制定可持續控制煙粉虱危害的方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

采用的煙粉虱 MED 隱種為中國農業科學院植物保護研究所生物入侵研究室飼養種群，亞洲Ⅱ3隱種為2016年在廣東偶然采得，帶回室內于番茄苗上飼養并通過COI的方法鑒定其生物型為亞洲Ⅱ3隱種，并在室內飼養種群，均以番茄Lycopersicum esculentum Mill （‘中雜九號）為寄主植物飼養，無用藥史，溫室飼養溫度為（26±1）℃，相對濕度 60%～80%，光周期為L∥D=16 h∥8 h。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

Implen超微量紫外可見分光光度計（NanoPhotometer TM PClass）、高低溫控溫設備（K6CCNR，德國Huber）、臺式低溫離心機（艾本德）、實時熒光定量 PCR 儀（7500型）（美國ABI公司）、普通 PCR 儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠電泳成像系統均為美國 BioRad 公司的產品。

1.2.2 主要試劑

實時熒光定量PCR試劑和耗材盒購自美國BioRAD公司、RNA 提取試劑Trizol Regent 購自 Invitrogen 公司；反轉錄試劑盒（Super Script FirstStrand Synthesis System）、TransStartTaq DNA Polymerase 及 PCR 相關試劑（dNTPs mix、10×TransStartTaq Buffer）、引物合成與產物測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 低溫脅迫處理

每個隱種各取200頭成蟲于1.5 mL離心管中，置于低溫（0、12℃）和高溫（35、40℃）環境中分別進行脅迫處理1、3、5 h，室溫26℃作為對照，每個處理做3個生物學重復。處理結束后立即液氮冷凍5 min，于-80℃保存。

1.3.2 抗寒基因的引物設計與合成

選擇EF1α、βtub兩個基因作為內參基因，其在煙粉虱體內表達穩定，特異性強[13]，且研究證明選擇一個內參基因易使表達分析出現較大誤差，選擇兩個內參基因進行相對定量試驗可獲得更為準確、可信度更高的試驗結果。根據本實驗室前期煙粉虱轉錄組分析得到的數據，確定erythrocyte binding protein、trehalase、dopadecarboxylase 3個基因為潛在的抗寒關鍵基因，利用Primer Premier 5.0設計，Oligo軟件分析定量引物，具體見表 1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 總RNA 的提取及cDNA第一鏈的合成

將脅迫處理過的200頭煙粉虱成蟲提取總RNA，采用Trizol（Invitrogen，USA）一步法進行提取，采用紫外比色和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA 的純度和完整度。根據熒光定量標準曲線結果確定將其定量為1 000 ng（反轉錄后可通過分光光度計檢測cDNA濃度微調其含量至1 000 ng），采用Super Script FirstStrand Synthesis System 試劑盒進行反轉錄合成第一鏈cDNA，并于-20℃保存備用。

1.3.4 實時熒光定量 PCR

實時熒光定量PCR試驗體系： Mix 10 μL，染料0.4 μL，引物F（10 pmol）0.4 μL，引物R（10 pmol） 0.4 μL，cDNA模板1 μL，補充DEPC水至20 μL。反應程序：94℃ 50 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環，繪制65～95℃熔解曲線。除生物學重復外，每個脅迫處理得到的cDNA模板做3個技術重復以減小試驗誤差。

1.3.5 數據統計分析

通過定量 PCR 測定出5個基因（包含內參）的 CT 值，取3個技術重復CT值的平均值進行數據統計分析（數值相差在 0.5 以內可用，3 個數值中有 2 個或 3個接近，數值可用，否則重做）。使用2-ΔΔ CT法進行計算，2-ΔΔ CT計算公式[16]：2-ΔΔ CT=2-[（CT 對照組-CT對照組（內參））-（CT 待測組-CT待測組（內參））]。

采用SPSS13.0軟件（SPSS Inc.， USA）進行數據分析，Oneway ANOVA 進行數據差異性分析，顯著性檢驗水平均為P≤0.05。

2 結果

2.1 高低溫脅迫下抗寒基因表達分析

對前期轉錄組篩選獲得的3個重要抗寒基因進行實時熒光定量 PCR，各隱種對照組測定的基因表達量定為1，分析處理組的相對表達量。根據方差分析結果制作柱形圖，比較高低溫脅迫過程中兩個隱種體內同一基因的表達變化趨勢，分析兩個隱種之間，同一基因在相同脅迫處理下表達的差異。

2.1.1 Erythrocyte binding protein基因表達分析

2.1.1.1 不同溫度脅迫下Erythrocyte binding protein基因相對表達量的變化趨勢

低溫脅迫5 h內，兩個隱種體內erythrocyte binding protein基因的表達均發生上調（圖1a，1b）；在高溫脅迫5 h內，兩個隱種體內erythrocyte binding protein基因的表達趨勢基本一致，均先上調后下調（35℃脅迫處理下，僅入侵種MED隱種發生了顯著的變化，如圖1a，1b）。

2.1.1.2 相同脅迫條件下煙粉虱兩個隱種體內Erythrocyte binding protein基因相對表達量的對比分析

由2.1.1.1結果可知低溫脅迫下兩個隱種體內erythrocyte binding protein基因的表達均發生上調，但通過兩者的對比分析，我們發現在煙粉虱MED隱種體內，erythrocyte binding protein基因僅在脅迫1 h時就發生了顯著的上調，而亞洲Ⅱ3隱種在脅迫3 h時才出現了上調，且上調的相對表達量低于煙粉虱MED隱種1 h時的表達量，如圖2a，2b；高溫脅迫下則無此現象發生，如圖2c，2d。

2.1.2 Trehalase基因表達分析

2.1.2.1 不同溫度脅迫下trehalase基因相對表達量的變化趨勢

低溫脅迫5 h內，兩個隱種體內trehalase基因表達均下調，如圖3a，3b；在高溫脅迫5 h內，兩個種群體內trehalase基因的表達趨勢基本一致，均發生一定的下調，如圖3a，3b。

2.1.2.2 相同脅迫條件下煙粉虱兩個隱種體內trehalase基因相對表達量的對比分析

與erythrocyte binding protein基因相同的是煙粉虱MED隱種體內的trehalase基因在脅迫1 h時發生了顯著的下調，而亞洲Ⅱ3隱種在脅迫3 h時才出現了下調，且下調的相對表達量低于煙粉虱MED隱種1 h時的表達量，如圖4a，圖4b；高溫脅迫下則無此現象發生，如圖4c，4d。

2.1.3 Dopa decarboxylase基因表達分析

2.1.3.1 不同溫度脅迫下Dopa decarboxylase基因相對表達量的變化趨勢

低溫脅迫5 h內，兩個隱種體內dopa decarboxylase基因的表達均先上調后再發生下調（圖5a，5b）。在高溫脅迫5 h內，兩個隱種體內dopa decarboxylase基因的表達趨勢也基本保持一致，均發生一定的上調（5a，5b）。

2.1.3.2 相同脅迫條件下煙粉虱兩個隱種dopa decarboxylase體內相對表達量的對比分析

與前兩者不同的是低溫脅迫5 h內，dopa decarboxylase基因發生上調的時間基本一致，再發生下調時間與erythrocyte binding protein、trehalase基因的規律是一致的，即煙粉虱MED種群體內dopa decarboxylase基因在3 h就開始下調，而亞洲Ⅱ3隱種則需在5 h才開始下調；而且相對于本地種（亞洲Ⅱ3隱種），入侵種（煙粉虱MED隱種）能更快速地做出調節來適應低溫環境，如圖6a，6b；高溫脅迫下則無此現象發生，如圖6c，6d。

3 討論

低溫脅迫是對昆蟲耐寒性的檢驗，昆蟲耐寒性是對低溫環境長期適應中通過本身的遺傳變異和自然選擇獲得的一種適應性。短時低溫脅迫是指昆蟲在較短時間內承受突然降溫帶來的沖擊，并對其產生反應，短時低溫脅迫并不是極端寒冷下的耐寒能力，而是在 0℃左右開始被激發，這與季節性低溫脅迫及長期低溫脅迫完全不同。短時低溫脅迫時，細胞膜和細胞器最先受到損害，低溫使其膜結構改變，流動性變差，失去滲透性，并導致離子的重新組合[17]，還會損傷線粒體的功能。在昆蟲生長發育的各個時期，均有短時低溫脅迫的發生，此方面的報道最早來自紅尾肉蠅Sarcophaga crassipalpis、榆葉甲Xanthogaleruca luteola、乳草蝽 Oncopeltus fasciatus[1819]，目前已經對彈尾目[20]、鞘翅目[21]、雙翅目[2223]、半翅目[24]、纓翅目[25]以及蜱螨亞綱[2637]進行了研究。例如在鱗翅目的幼蟲至成蟲均有短時低溫脅迫的發生，甚至是卵期，且不同昆蟲種類及發育階段條件下快速低溫脅迫產生的效應是不同的。而短時高溫脅迫也能協助了解基因在環境脅迫下的變化，從而更完整地掌握許多與溫度調控相關基因的調控機制。

煙粉虱MED隱種是世界上危害最大的入侵物種之一，在入侵過程中對中國以及其他多個國家和地區的許多農作物造成毀滅性危害。一項在中國和澳大利亞完成的研究揭示，這一害蟲的交配行為能幫助其入侵土著煙粉虱種群的領地，將危害性不大的土著煙粉虱滅絕并予以取代[28]。所以了解入侵機制對害蟲管理很重要，因為這能幫助研究人員就外來害蟲入侵以及取代土著近緣生物的范圍和速度作出準確預警。近幾年來，在我國東北逐漸發現煙粉虱MED隱種的危害，說明該物種正在適應更低的氣溫逐漸向我國北部嚴寒地區入侵，而我國本地種亞洲Ⅱ3隱種，目前仍僅存在于浙江、廣州一帶[67]，沒有向其他地區擴散的趨勢，因此，研究煙粉虱耐寒機制對研究其入侵機制至關重要，研究兩個隱種之間的差異表達對探索煙粉虱MED隱種如何成功入侵有很大的幫助。在抵御外界逆境時，熱激蛋白、TRP等基因[2930]會通過調節昆蟲體內某種物質含量從而抵御多種逆境，因此本研究也通過短時高溫脅迫來了解這3種基因在短時高溫下表達量的變化趨勢，從而幫助我們完整地了解3種抗寒基因在調控溫度適應機制時所產生的具體作用。

前期研究發現熱激蛋白（heatshock proteins，HSPs）在抗寒過程中發揮著重要的功能，除了熱激蛋白對抗寒過程具有調控作用外，本研究發現一些激素類物質合成和降解的基因也在煙粉虱抗寒過程中發揮著作用，如dopa decarboxylase、trehalase和erythrocyte binding protein。海藻糖作為昆蟲的血糖，具有對熱、冷、營養缺乏、缺水、氧化試劑等多種不良刺激的耐受性[910]，能夠保護生物膜的完整性和維持生物活性，從而保護細胞免受凍傷[11]。本試驗發現煙粉虱入侵種和本地種的海藻糖酶基因一直在調控整個高低溫脅迫過程（圖3），表明海藻糖酶基因能夠通過控制煙粉虱的海藻糖含量來調控其抗逆過程。Ueno 等[12]研究發現果蠅在遇到寒冷環境時，代謝率會提高，并且多巴胺含量有變化，表明多巴胺對果蠅行為變化的影響具有溫度敏感性。本試驗中，多巴脫酸酶基因明顯表達調控煙粉虱入侵種整個抗寒過程（圖4），這說明多巴胺確實在煙粉虱MED隱種抵御寒冷環境中起到一定的作用。此外，本研究發現erythrocyte binding protein基因在煙粉虱兩個隱種的整個抗逆過程中也發揮了重要的作用。對比抗寒基因在兩個隱種體內表達的異同，發現短時低溫脅迫下，兩個隱種體內的三個抗寒基因均受低溫誘導，相對于本地種（亞洲Ⅱ3隱種），入侵種（煙粉虱MED隱種）能更快地對低溫環境做出響應，推測其能調控相關抗寒物質含量來抵御低溫環境，進一步推測這可能是其能快速適應不同氣候環境的重要機制之一。而在短時高溫脅迫下，抗寒基因在兩個隱種體內發揮了相似的作用，即能受高溫誘導做出響應，推測其能適當調控高溫帶來的損傷。

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（責任編輯：田 喆）