聚多曲霉Snef210對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)毒性的研究

王帥 郭龍玉 朱曉峰

摘要 蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病在我國(guó)乃至世界危害日益嚴(yán)重，安全防控該病害成為目前急需解決的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問(wèn)題。本研究篩選到一株可毒殺南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita的生防真菌Snef210，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為聚多曲霉Aspergillus sydowii （Bain.et Sart.） Thomet Church。該菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)（J2）具有很強(qiáng)的毒殺作用，原液處理24 h后校正死亡率達(dá)90.1%，處理3 d后對(duì)卵孵化的抑制率達(dá)92.8%。盆栽試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，菌株發(fā)酵液10倍稀釋液土壤處理對(duì)番茄根部的根結(jié)減退率為66.7%。聚多曲霉代謝產(chǎn)物豐富，多用于抗菌和抗腫瘤的研究，本文首次發(fā)現(xiàn)其對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有效，是一類(lèi)潛在的控制植物線(xiàn)蟲(chóng)病害的新型生防因子。

關(guān)鍵詞 聚多曲霉； 南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)； 番茄； 毒性

中圖分類(lèi)號(hào)： S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018045

Abstract Disease of root-knot nematode （RKN） is becoming more serious in China and other countries. It is an urgent problem to control this nematode in agricultural production. Snef210 was screened with high efficacy againstMeloidogyne incognitaand identified asAspergillus sydowii with morphological and molecular analysis. Second stage juveniles （J2） and egg capsules were immersed in Snef210 with in vitro methods. The results showed the corrected mortality of J2was 90.1% at 24 h. Moreover， Snef210 exhibited high ovicidal effect with the efficacy of 92.8% at 3 d. Root-knot index treated with diluted ten-fold Snef210 fermentation broth was decreased by 66.7% in pot experiment.A. sydowii is rich in metabolic products， mostly used in antibacterial and anti-tumor studies. Snef210 had strongly toxicity toM. incognita and could be regarded as a novel potential biocontrol agent against RKNs.

Key words Aspergillus sydowii； Meloidogyne incognita； tomato； toxicity

近年來(lái)，隨著日光溫室等設(shè)施園藝種植模式在北方的大面積推廣應(yīng)用，南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)Meloidogyne incognita 得以越冬存活，致使根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)展成為東北地區(qū)危害設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的重要土傳病害之一，制約了設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)是在植物根系內(nèi)定殖的專(zhuān)性?xún)?nèi)寄生病原物，因其分布范圍廣和寄主種類(lèi)多的特點(diǎn)，給許多國(guó)家的農(nóng)林產(chǎn)業(yè)造成巨大損失，已成為世界上威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物之一[1]。

隨著科技的進(jìn)步和人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，從生態(tài)角度尋求控制根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治新方法成為研究熱點(diǎn)[2-3]。生防真菌因種類(lèi)繁多且代謝產(chǎn)物豐富多樣，在植物線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治研究中最早被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用[4]。我國(guó)研究人員陸續(xù)報(bào)道不同種類(lèi)真菌在根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病中的研究，如哈茨木霉對(duì)黃瓜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果顯著[5]，青霉菌的代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物線(xiàn)蟲(chóng)有強(qiáng)烈的毒殺作用且對(duì)環(huán)境影響小[6]，李頌等施用黑曲霉次生代謝產(chǎn)物的處理降低了番茄的根結(jié)指數(shù)和根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)種群數(shù)量，促進(jìn)了番茄植株的生長(zhǎng)[7]。

聚多曲霉Aspergillus sydowii亦稱(chēng)為喜多氏曲霉，是自然界重要的生物資源。屬于絲孢菌目叢梗孢科曲霉屬的一個(gè)種，可生長(zhǎng)在土壤、糞便、酒曲等多種材料的基物上[8]。聚多曲霉代謝產(chǎn)物非常豐富，目前研究主要集中于抗菌、抗病毒[9-10]以及抗癌活性[11]，但是尚未見(jiàn)到應(yīng)用其防治根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的研究。本文在研究根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌的活性篩選過(guò)程中，分離獲得一株高效的生防真菌Snef210，經(jīng)鑒定為聚多曲霉A.sydowii，并進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定和盆栽防效試驗(yàn)，以驗(yàn)證其生防潛力，為植物線(xiàn)蟲(chóng)病害的生物防治提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 真菌Snef210菌株的鑒定

1.1.1 供試菌株與菌株發(fā)酵液

供試真菌Snef210菌株，由本實(shí)驗(yàn)室從遼寧省沈陽(yáng)市康平試驗(yàn)基地大豆田土壤中分離獲得。菌株培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar， PDA），菌株純化和鑒定采用查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek-Dox agar， CDA），菌株保存采用10%的甘油放置于-80℃冰箱中。選取平板上生長(zhǎng)良好的菌落，取直徑1 cm的菌餅接種于含有150 mL馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液的三角瓶中，120 r/min，27℃條件下?lián)u床中振蕩培養(yǎng)5 d，獲得真菌發(fā)酵液原液。發(fā)酵液原液5 000 r/min離心15 min，獲得發(fā)酵液上清液，作為菌株發(fā)酵液保存到4℃冷庫(kù)中備用。

1.1.2 菌株Snef210的鑒定

主要依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定以及ITS、β-tubulin序列分析方法對(duì)Snef210菌株進(jìn)行鑒定。將菌株Snef210進(jìn)行單孢分離，接種到PDA、CDA平板上培養(yǎng)，采用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡對(duì)菌落、菌絲和孢子等結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，參照《中國(guó)真菌志》[8]進(jìn)行鑒定。

利用TIANGEN公司的DNA提取試劑盒提取菌株Snef210總DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和ITS4： TCCTCCGCTTATTGATATGC[12]，以及β-tubulin基因間隔區(qū)通用引物Bt2a：GGTAACCAAATCGGTGCTGCTT 和 Bt2b：ACCCTCAGTGTAGTG-ACCCTTGGC[13]。ITS擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30次循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃下保存。β-tubulin擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性50 s，53℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物由上海生物工程有限公司純化測(cè)序，并將測(cè)序獲得的序列結(jié)果提交NCBI（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov）， 進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，然后通過(guò)MEGA 6.0 軟件采用Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在分子水平鑒定菌株的種類(lèi)。

1.2 供試南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵與2齡幼蟲(chóng)J2

采集鐵嶺市李千戶(hù)鎮(zhèn)營(yíng)盤(pán)村溫室大棚中南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)侵染的番茄根系，用水輕輕沖掉根上泥土，取下卵囊放在自制的孵化池中，0.5%的NaClO消毒3 min，之后用無(wú)菌水沖洗5次，將處理后的卵囊懸液置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h收集一次新孵化的南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 真菌Snef210發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的毒力測(cè)定

1.3.1 發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2活性的影響

取直徑6 cm一次性培養(yǎng)皿，加6 mL離心處理后的發(fā)酵液上清液，并挑取100條J2置于其中，分別在處理6、12、24、36、48、60 h后，統(tǒng)計(jì)死亡根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2數(shù)量，試驗(yàn)前期線(xiàn)蟲(chóng)死亡通過(guò)線(xiàn)蟲(chóng)彎曲程度或用挑針刺激法判斷[14-15]。最后一次檢驗(yàn)時(shí)，線(xiàn)蟲(chóng)死亡通過(guò)亞甲基藍(lán)水溶液判斷，每個(gè)皿中加入2滴0.05%亞甲基藍(lán)水溶液10 min時(shí)鏡檢，蟲(chóng)體藍(lán)色為死蟲(chóng)，不著色為活蟲(chóng)[16]。1.8%阿維菌素乳油稀釋1 000倍為藥劑處理對(duì)照，以無(wú)菌水處理為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)下列公式計(jì)算死亡率和校正死亡率：

死亡率= 死亡線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)/處理線(xiàn)蟲(chóng)總數(shù)×100%；

校正死亡率=（處理線(xiàn)蟲(chóng)死亡率-對(duì)照線(xiàn)蟲(chóng)死亡率）/（1-對(duì)照線(xiàn)蟲(chóng)死亡率）×100%。

1.3.2 發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的抑制作用

分別取10個(gè)卵囊經(jīng)表面消毒放入自制的孵化池中，孵化池放入直徑為6 cm的一次性培養(yǎng)皿中，皿中分別裝有10 mL發(fā)酵液和1.8%阿維菌素乳油1 000倍稀釋液為處理1和處理2，設(shè)置10 mL無(wú)菌水為對(duì)照處理。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，25℃條件下培養(yǎng)箱中孵化，3、5、7 d后在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)孵化出的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量，并依照公式計(jì)算出卵孵化的相對(duì)抑制率：

相對(duì)抑制率=（對(duì)照孵化線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)-處理孵化線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)）/對(duì)照孵化線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)×100%。

1.4 盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證真菌Snef210發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防效

Snef210發(fā)酵液稀釋10倍后用于盆栽試驗(yàn)。將番茄‘L402的種子用1.0%的NaClO消毒5 min，用無(wú)菌水沖洗5次，播種于72孔蛭石穴盤(pán)中，溫室中培養(yǎng)（白天26℃，晚上16℃）。當(dāng)番茄苗長(zhǎng)到2葉1心期時(shí)將苗移到塑料盆缽中（直徑25 cm，高30 cm），每缽使用高溫滅菌處理的混合培養(yǎng)基質(zhì)1 000 g（基質(zhì)∶沙∶土=1∶1∶1）。混合基質(zhì)中加200 mL稀釋10倍的發(fā)酵液充分混勻作為處理1，加100 mL稀釋10倍的發(fā)酵液和100 mL 1.8%阿維菌素乳油稀釋1 000倍液為處理2，加200 mL無(wú)菌水為空白對(duì)照，加200 mL 1.8%阿維菌素乳油稀釋1 000倍液為藥劑對(duì)照，每個(gè)處理10盆，每盆一株番茄苗。番茄移栽5 d后接種1 500條南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2，接種45 d后調(diào)查根結(jié)指數(shù)。采用肖炎農(nóng)等[17]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病情級(jí)數(shù)，并分別稱(chēng)量不同處理下每株番茄根冠質(zhì)量，按照下列公式計(jì)算根結(jié)指數(shù)和根結(jié)減退率：

根結(jié)指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別數(shù)）×100；

根結(jié)減退率=（對(duì)照根結(jié)指數(shù)-處理根結(jié)指數(shù)）/對(duì)照根結(jié)指數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)由SPSS Statistics18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)與Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較來(lái)分析數(shù)據(jù)（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Snef210的鑒定

菌株Snef210在查氏瓊脂培養(yǎng)基上25℃條件下7 d時(shí)直徑達(dá)到24.0 mm，菌絲絨狀至絮狀，致密；菌落顏色灰藍(lán)色（圖1a）；14 d時(shí)菌落直徑達(dá)到51.4 mm，菌落逐漸變?yōu)榘邓{(lán)色，有淡褐色區(qū)域。7 d時(shí)已具大量滲出液，褐色或黃褐色（圖1a）；基本無(wú)氣味或具輕微霉味。菌落反面暗褐色，近于栗黑色，色素?cái)U(kuò)散于基質(zhì)中（圖1b）。分生孢子頭球形至輻射形，直徑平均約為75.4 μm，小分生孢子頭似青霉?fàn)睿适杷芍位蛏y（1c）；分生孢子梗直接生于基質(zhì)，有的生于氣生菌絲，孢梗莖長(zhǎng)大多在140.7～210.5 μm，直徑4.7～8.1 μm，壁較厚，光滑。頂囊較小，近球形或稍呈橢圓形，直徑8.3～15.2 μm，幾乎全部表面可育（圖1c，d）；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層：梗基（4.3～10.4）μm×（2.0～4.0）μm，有的小分生孢子頭僅分生孢梗莖頂端稍膨大后生出產(chǎn)孢細(xì)胞（圖1c，d）；分生孢子為球形或近球形，直徑2.5～5.2 μm，壁明顯粗糙，具小刺（圖1d）。

將測(cè)序獲得的序列結(jié)果提交NCBI，獲得ITS和β-tubulin序列號(hào)分別為KY908307和MG831183。通過(guò)ITS和β-tubulin序列分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)真菌的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該菌株與已知真菌聚多曲霉KJ463376.1和LN898876.1在ITS序列同源性上達(dá)到99%，在β-tubulin序列同源性上為100%。綜合考慮菌株Snef210的形態(tài)特征與基因測(cè)序結(jié)果，表明該菌株屬于聚多曲霉Aspergillus sydowii （Bain.et Sart.） Thomet Church。

2.2 真菌Snef210菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的毒性

為了驗(yàn)證真菌Snef210發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的毒性，本研究利用1.8%阿維菌素乳油1 000倍稀釋液為藥劑對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除處理36 h外，其余時(shí)間兩者處理間J2校正死亡率無(wú)顯著性差異（圖4）。Snef210發(fā)酵液處理南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2后6 h時(shí)其校正死亡率達(dá)81.1%，而1.8%阿維菌素稀釋液處理線(xiàn)蟲(chóng)6 h時(shí)其校正死亡率稍低，校正死亡率為78.1%；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，兩種處理的線(xiàn)蟲(chóng)死亡數(shù)都持續(xù)增加，24 h時(shí)兩種處理的校正死亡率都超過(guò)90%，且24 h以后 1.8%阿維菌素稀釋液處理線(xiàn)蟲(chóng)校正死亡率稍高于發(fā)酵液處理南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)校正死亡率，但兩者無(wú)顯著差異（圖4）。綜上可知真菌Snef210發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的毒性與稀釋1 000倍的1.8%阿維菌素基本一致（36 h除外）。

2.3 真菌Snef210發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化的抑制作用

真菌Snef210發(fā)酵液處理南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵囊后，3 d時(shí)Snef210發(fā)酵液和1.8%阿維菌素乳油稀釋液對(duì)卵的孵化都起到很好的抑制效果，Snef210發(fā)酵液對(duì)卵囊孵化的相對(duì)抑制率達(dá)到92.8%，且0.05水平差異不顯著；處理5 d和7 d時(shí)，Snef210發(fā)酵液雖然也能夠顯著抑制卵孵化，但相對(duì)抑制率顯著低于阿維菌素，分別為44.1%與50.6%，說(shuō)明Snef210發(fā)酵液前期對(duì)卵囊孵化抑制效果較好（圖5）。

2.4 溫室盆栽試驗(yàn)效果

在接種線(xiàn)蟲(chóng)45 d后調(diào)查盆栽番茄根結(jié)指數(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株Snef210發(fā)酵液處理番茄后根結(jié)指數(shù)為17.5，明顯低于對(duì)照根結(jié)指數(shù)52.5，根結(jié)減退率達(dá)到66.7%（表1）。Snef210發(fā)酵液與1.8%阿維菌素乳油混用的防治效果好于單獨(dú)使用阿維菌素處理，但是差異不顯著。Snef210發(fā)酵液與1.8%阿維菌素混用處理番茄后植株生物量有顯著提高，根結(jié)減退率也最高，防效最好（表1），處理后的番茄須根比空白對(duì)照發(fā)達(dá)，而對(duì)照僅有少量須根。可以看出Snef210發(fā)酵液不僅可以控制線(xiàn)蟲(chóng)的侵染，促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)，還可以與阿維菌素混合使用增強(qiáng)效果。

3 討論

Snef210菌株經(jīng)鑒定為聚多曲霉，其發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2有較強(qiáng)的毒性作用，也能顯著抑制南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化，與1.8%阿維菌素乳油作用效果相當(dāng)。盆栽試驗(yàn)顯示該菌發(fā)酵液能顯著減少根結(jié)數(shù)量，并可以和阿維菌素混配增強(qiáng)防效。研究結(jié)果顯示該菌發(fā)酵液中存在對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有較強(qiáng)毒殺作用的代謝物質(zhì)，但具體是哪些物質(zhì)起作用，是單一物質(zhì)還是多種物質(zhì)共同作用，有待進(jìn)一步的研究。

曲霉是自然界重要的微生物資源，在線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治中很早就被發(fā)現(xiàn)和利用，其中曲霉屬、木霉屬、青霉屬和擬青霉屬在線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治中研究較多[18-20]，本實(shí)驗(yàn)室也曾篩選到一些曲霉菌屬和青霉菌屬的生防菌[7，15]。青霉菌在根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治中還處于簡(jiǎn)單的篩選和應(yīng)用，在抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的機(jī)理方面沒(méi)有木霉菌屬和擬青霉菌屬研究深入。相關(guān)研究認(rèn)為曲霉中的檸檬酸、草酸、曲酸等酸性物質(zhì)是抑制根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的重要原因[21-23]。與報(bào)道的曲霉產(chǎn)生酸性物質(zhì)不同，木霉菌屬和擬青霉菌屬生防菌株可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶等寄生于線(xiàn)蟲(chóng)的卵塊和2齡幼蟲(chóng)來(lái)拮抗南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)[24-25]，也可以產(chǎn)生一些絲氨酸蛋白酶等毒性物質(zhì)殺死線(xiàn)蟲(chóng)J2，并且抑制卵孵化[26-27]。本研究鑒定到聚多曲霉Snef210菌株對(duì)番茄南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)有很好的防治效果，但其是否同其他曲霉一樣是代謝物中的酸類(lèi)物質(zhì)在起作用，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

人們研究發(fā)現(xiàn)聚多曲霉能夠產(chǎn)生多種抗真菌物質(zhì)如棘球白素[28]、抗病毒的活性物質(zhì)[9]，同時(shí)也能夠產(chǎn)生一些對(duì)人類(lèi)細(xì)胞瘤有較高毒性的物質(zhì)[29]，其中一種二酮哌嗪類(lèi)新化合物對(duì)黑素瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性[30]。Trisuwan研究得到3種新倍半萜烯類(lèi)與2種新氧雜蒽酮類(lèi)物質(zhì)，并評(píng)估了這些物質(zhì)的抗氧化能力[31]。因此，該菌產(chǎn)生的這些毒性產(chǎn)物和抗氧化物質(zhì)在引起根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2的死亡及抑制卵孵化起到多少作用也需要驗(yàn)證。此外，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其在降解農(nóng)藥中的作用，如可以降解甲基對(duì)硫磷[32]、敵草隆[33]、S-氰戊菊酯[34]和敵百蟲(chóng)[35]等農(nóng)藥。除了能降解多種農(nóng)藥，該菌能降解甲醛等有毒物質(zhì)[35]。可見(jiàn)聚多曲霉具有多樣化功能，是重要的環(huán)境用真菌，其具有的特性必將為聚多曲霉的應(yīng)用添加優(yōu)勢(shì)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）