腫節(jié)風炭疽病拮抗細菌的篩選與鑒定

宋利沙 蔣妮 繆劍華

摘要 為篩選出對腫節(jié)風炭疽病菌Colletotrichum dematium具有拮抗作用的細菌，開發(fā)新型生物制劑，本試驗分別采用組織分離法和稀釋平板法，從廣西藥用植物園科研基地健康腫節(jié)風植株的不同組織和根系土壤分離、純化獲得49株細菌。平板對峙試驗結(jié)果表明，來自土壤的zjt-9、zjt-4，來自根系的zgs21及葉片的zyy13對腫節(jié)風炭疽病菌具有較強的拮抗作用，其中作用最強的是zjt-9。抗菌譜測定結(jié)果表明， zjt-9、zjt-4和 zyy13對供試的18種病原真菌均有明顯的拮抗效果，拮抗作用最強的是zjt-9，平均抑菌寬度最高達19.10 mm；經(jīng)顯微鏡觀察，拮抗細菌可造成腫節(jié)風炭疽病病原菌菌絲膨大、畸形、斷裂。通過形態(tài)學特性和16S rDNA鑒定，zjt-9菌株為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillus methylotrophicus。

關(guān)鍵詞 腫節(jié)風； 炭疽病； 拮抗細菌； 篩選； 鑒定

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018061

Abstract In order to develop new biocontrol agents with stable antagonistic effect onColletotrichum dematiumofSarcandra glabra， a total of 49 strains of bacteria were isolated from different tissues of healthy plants and soils in the Guangxi Medicinal Botanical Garden Research Base by dilution method and tissue isolation tests. The results of plate confrontation test showed that zjt-9， zjt-4， zgs21 and zyy13 had antagonistic effect on the anthracnose ofS. glabra； one strain of bacterium with promising antagonistic activity was obtained， which was strain zjt-9. Strains of zjt-9 and zjt-4 were isolated from soil， strains of zgs21 and zyy13 were isolated from plant roots and seedling leaves； antibacterial spectrum tests showed that it had significantly antagonistic activities to 18 plant pathogens， and zjt-9 had the strongest antagonistic activity with an antagonism width of 19.10 mm. When observed under the microscope， the mycelia ofC. dematiumwere swollen， abnormal and cracked. Based on morphological and 16S rDNA sequence analysis， strain zjt-9 was identified asBacillus methylotrophicus.

Key words Sarcandra glabra； anthracnose； antagonistic bacterium； screening； identification

腫節(jié)風為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.） 的干燥全草，又名九節(jié)茶、接骨金粟蘭等，主要分布于我國華南、 華東、西南各省區(qū)，在朝鮮、日本、東南亞和印度也有分布[1]。其具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡(luò)等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜，風濕痹痛，跌打損傷等癥，是中國藥典的收錄品種[2]，還是廣西重要的傳統(tǒng)瑤藥品種“七十二風”中重要的風藥品種之一[3]。現(xiàn)代藥理和毒理研究表明，腫節(jié)風還具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤和促進骨折愈合及鎮(zhèn)痛等多種活性，急性毒性試驗結(jié)果顯示其無毒，具有較好的安全性[4]。以腫節(jié)風為主要原料的制劑有草珊瑚含片、腫節(jié)風片、腫節(jié)風注射液、血康口服液等[5]。腫節(jié)風在廣西靖西、融安、東蘭等縣大面積種植過程中，出現(xiàn)了一種由半知菌類炭疽屬黑線炭疽菌Colletotrichum dematium引起的嚴重的葉部病害，前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害平均發(fā)生率達50%以上，特別在融安的林下套種模式，發(fā)病率高達65%[6]，開展腫節(jié)風病害的研究和防治具有重要意義。

以化學藥劑防治腫節(jié)風炭疽病[7]可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，病害易復(fù)發(fā)，以及農(nóng)藥殘留等問題。利用生防菌防治植物病害，因其具有對環(huán)境安全的優(yōu)點，已經(jīng)成為防治植物病害的重要方法之一，是目前國內(nèi)外研究熱點，也是未來綠色中藥材發(fā)展的趨勢。植物內(nèi)生細菌可分布于植物不同組織中，靠植物提供營養(yǎng)物質(zhì)，受植物組織的保護，不受外部環(huán)境的影響，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境。因此，內(nèi)生細菌相對于附生細菌更易發(fā)揮生防作用，其防病機理主要表現(xiàn)有產(chǎn)生抗生素類、水解酶類、植物生長調(diào)節(jié)劑和生物堿類物質(zhì)，或與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或空間，增強宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑抑制病原菌生長[8-9]。植物內(nèi)生細菌是植物病害防治的潛在生防資源菌，國內(nèi)外已有很多報道[9-12]。應(yīng)用拮抗微生物防治腫節(jié)風炭疽病，目前在國內(nèi)外尚未見報道，本研究擬從健康的腫節(jié)風植株的不同組織和根系土壤中分離篩選，找出能有效控制此病害的生防細菌，以期為腫節(jié)風炭疽病的生物防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：腫節(jié)風炭疽病菌為黑線炭疽菌Colletotrichum dematium，編號Z1，由本實驗室分離鑒定保存。供試18種病原菌，即稻胡麻斑病菌Bipolaris oryzae、三七灰霉病菌Botrytis sp.、三七根腐病菌Fusarium solani、香蕉煤紋病菌Helminthosporium torulosum、煙草黑脛病菌Phytophthora parasitica、豆蔻葉斑病菌Phyllosticta sp.、香蕉葉斑病菌Alternaria sp.、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、苦玄參葉斑病菌Alternariasp.、香蕉炭疽病菌Colletotrichumsp.、煙草立枯病菌Rhizoctonia solani、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum、三七黑斑病菌Alternaria panax、廣西莪術(shù)葉斑病菌Phomopsis sp.、煙草灰霉病菌Botrytis cinerea、香蕉煤紋病菌Helminthosporium torulosum、三七炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、艾納香褐斑病菌Phoma sp.，均是本植物病理研究室保存的菌株。

樣品來源：在廣西藥用植物園科研基地，采集腫節(jié)風不同種植區(qū)三年生和幼苗健康植株以及其根系土壤，分別從東、西、南、北4個方位采集健康植株各5株（包括根、莖、葉）以及其根系土壤，共372個樣品，編號封存于保鮮袋中，帶回實驗室進行細菌的分離。

供試培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基（用于植物病原真菌培養(yǎng)及菌株拮抗效果測定）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，蒸餾水1 000 mL；NA培養(yǎng)基（用于拮抗細菌分離純化培養(yǎng)）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，瓊脂 15.0～20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離、純化和保存

采用組織分離法，即將健康的腫節(jié)風的根、莖、葉片用75%乙醇、無菌水擦拭干凈，晾干，加入 10 mL無菌水和少量石英砂研磨成勻漿制成 10-1 濃度的原液，用移液槍吸取1 mL上層液體到裝有9 mL無菌水的試管中，振蕩均勻得到10-2 濃度。按此方法再將液體稀釋到 10-3，10-4，10-5、10-6濃度備用。分別吸取不同濃度的液體 0.1 mL 均勻涂布到NA培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)3 次。將涂布好的平板放入恒溫培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣整齊度、干濕等特征，挑取不同性狀的細菌菌落在NA平板上劃線純化、編號。將純化好的細菌在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 根系土壤細菌的分離

稱取腫節(jié)風的新鮮根際土樣10.0 g放入裝有90 mL無菌水廣口瓶中，搖床振蕩20 min，制成土壤懸液（10-1）。從中取1 mL 土壤懸液注入盛有9 mL無菌水的試管中，振蕩混勻（10-2）。依此類推制成10-3、10-4、10-5、10-6和10-7各種稀釋度的土壤溶液備用。分別吸取上述不同稀釋度的土壤溶液0.1 mL至準備好的NA平板上，均勻涂布，每處理重復(fù)3次。放置28℃恒溫培養(yǎng)，48 h后記錄，然后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣、干濕等特征，挑取性狀不同的菌落，在NA平板上進行劃線純化、編號、培養(yǎng)，在4℃保存?zhèn)溆肹14-15]。

1.2.3 拮抗菌的篩選

采用平板對峙法[16-17]初篩，在PDA平板離邊緣2 cm處接直徑5 mm的供試病原菌菌塊，在距菌3 cm處接種土壤中已分離純化的細菌菌株，以只接種病原菌菌塊為對照。每組設(shè)置3個重復(fù)，在28℃恒溫培養(yǎng)，7 d后觀測抑菌圈大小，篩選出對腫節(jié)風病菌有抑制作用的拮抗細菌。復(fù)篩與初篩方法一樣。

1.2.4 拮抗細菌抗菌譜的測定

采用平板對峙法，在離病原菌菌塊3 cm處接種待測拮抗細菌，以中央接病原菌作對照，不同處理的病原菌放在離平皿邊緣2 cm處；28℃恒溫培養(yǎng)6 d。每處理3次重復(fù)。測量病原菌菌落直徑和抑菌帶寬度。

1.2.5 拮抗菌株的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)鑒定

拮抗細菌經(jīng)無菌水稀釋適當濃度后，接種于NA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，長出單菌落后，觀察記錄菌落形態(tài)[18]。同時，對菌體進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)以及大小。

1.2.5.2 分子生物學鑒定

將培養(yǎng)3 d的拮抗菌株接種到40 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶（100 mL）中， 于28℃、180 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取細菌基因組DNA。采用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對提取的DNA進行PCR擴增，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。擴增反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進行，模板DNA （20～50 ng/μL） 0.5 μL，10×Buffer （含 Mg2+） 2.5 μL，dNTPs （各2.5 mmol/L） 1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后在72℃下修復(fù)延伸10 min。擴增中以水代替DNA模板為空白對照。用凝膠電泳法檢測PCR反應(yīng)結(jié)果，吸取4 μL PCR產(chǎn)物加入1%（W/V）瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液（0.9 mol/L Tris-Borate， 0.01 mol/L EDTA， pH=8.3）中，在110 V下電泳40 min。將擴增后的 DNA 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化測序。并且把測序結(jié)果與GenBank中的序列進行BLAST比對。以16S rDNA相似序列，利用MEGA 4.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 病原菌菌絲顯微鏡觀察

把菌落直接放置于倒置顯微鏡的載物臺上，觀察處理菌株和對照菌株菌絲體的形態(tài)變化，記錄并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

資料統(tǒng)計結(jié)果用x±s表示，x是平均值，s為標準差，各組數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進行單因素ANOVA分析，選用LSD和Duncan氏檢驗法進行組間的多重比較分析，方差同質(zhì)性檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌的分離與篩選

從腫節(jié)風健康植株組織（根、莖、葉）和根系土壤中共分離得到49株細菌，其中，抑菌帶<3 mm的有44株；在3～10 mm的有1株；抑菌帶在13～19 mm之間有4株（表1）。zjt-9和zjt-4分離自腫節(jié)風根系土壤，zgs21和zyy13分別來自三年生根和幼苗的葉片。zjt-9、zjt-4、zgs21和zyy13對炭疽病菌的抑菌帶寬度分別為18.50、16.00、15.25 mm和13.25 mm，其中抑菌帶寬度最高的是zjt-9，最低的是zyy13（表1）。從健康腫節(jié)風的根系土壤分離得到的細菌的拮抗作用強于在其健康組織分離得到的內(nèi)生細菌。

2.2 拮抗菌對腫節(jié)風炭疽病菌的抑制作用

內(nèi)生細菌和病原菌在對峙培養(yǎng)中，兩菌的菌落并未接觸，而病原菌靠近內(nèi)生菌的部分生長受阻。鏡檢結(jié)果顯示，正常生長的植物病原菌的菌絲粗細均勻、粗壯、光滑，生長菌絲舒展（圖2a）；對峙培養(yǎng)相向處的病原菌菌絲膨大、畸形、斷裂（圖2b～c）。

2.3 拮抗細菌抑菌譜

將拮抗細菌zjt-9、zjt-4、zgs21和zyy13對農(nóng)作物和藥用植物17種病原菌進行抑菌活性測定，平均抑菌帶寬度從大到小依次是zjt-9>zjt-4>zyy13>zgs21（表2）。綜上所述，拮抗細菌zjt-9、zyy13、zjt-4、zgs21對17種植物病原菌都有廣譜性，zjt-9對稻胡麻斑病B.oryzae抑制作用較強，具有生防的應(yīng)用前景。

2.4 拮抗菌株的鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定

菌株zjt-9在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色菌落，圓形或近圓形，表面濕潤半透明，邊緣整齊，無褶皺。菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.4.2 分子生物學鑒定

以 zjt-9基因組DNA為模板，用通用引物27F和1492R對16S rDNA序列進行PCR擴增，將獲得的擴增產(chǎn)物進行測序，得到大小為1 448 bp的核苷酸序列，菌株登錄號為MH259879。將該序列通過 BLAST程序與GenBank 中序列進行對比分析，結(jié)果顯示菌株zjt-9與其比對的芽胞桿菌屬同源，相似度高達99%，采用 MEGA 4.0 軟件以GenBank中16S rDNA相似序列及相似率達99%的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖3）表明，菌株zjt-9與多個B.methylotrophicus菌株序列在系統(tǒng)發(fā)育樹同一個分支上，且此菌均為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌，綜合菌株的形態(tài)學特征及分子生物學鑒定結(jié)果，拮抗菌株可初步鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌B.methylotrophicus。

3 結(jié)論與討論

對廣西腫節(jié)風主產(chǎn)區(qū)（靖西）的病害進行普查后發(fā)現(xiàn)，炭疽病是腫節(jié)風主要病害，發(fā)病時間長，發(fā)生普遍，造成中藥材減產(chǎn)和品質(zhì)下降，目前防治炭疽病主要采用化學藥劑，即在病害發(fā)生的時期，交替使用甲基硫菌靈和多菌靈等藥劑[7]。但是，長期施用化學農(nóng)藥，不僅給生態(tài)環(huán)境帶來一系列的負面影響，且易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，造成病害復(fù)發(fā)。

甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌B.methylotrophicus具有抗菌防病的功能，且具有抑菌廣譜性，對開發(fā)生物農(nóng)藥和制劑具有潛在的應(yīng)用價值。蔡麗等[19]從鳳凰單叢茶篩選出具有抑菌活性的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌，對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌的菌絲具有強的抑制作用，而對瓜果腐霉的菌絲抑制率很低。武利勤等[20] 從霍山石斛中分離出抑菌強的菌株RA，對石斛黑斑病菌的抑菌率達到70%，并對其他8種病原真菌具有較強的抑制效果，包括梨輪紋病菌、棉花黃萎病菌、白菜黑斑病菌、灰霉病菌、禾谷鐮孢菌、稻瘟病菌，其中RA對棉花黃萎病菌和禾谷鐮孢菌抑制效果最顯著，抑菌率分別為80.1%和86.9%，菌株RA對辣椒立枯病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌能力稍弱，抑菌率分別為54.8%和63.6%。本試驗首次發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌對腫節(jié)風炭疽病菌的拮抗作用且對17種供試病原菌均具較強的拮抗效果，包括香蕉、水稻、煙草、西瓜等9種農(nóng)作物病原真菌以及三七、艾納香、豆蔻、廣西莪術(shù)、苦玄參等9種藥用植物的病原真菌，由于腫節(jié)風炭疽病病害嚴重，因此，篩選出具有良好效果的生防菌株對腫節(jié)風產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究在實驗室條件下測定了分離篩選到的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌對病原菌的拮抗作用，其在田間的效果如何尚屬未知。另外其對腫節(jié)風生長有無促進作用，如何開發(fā)為生物農(nóng)藥及其使用方法等，有待進一步研究。

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（責任編輯：田 喆）