甘肅省玉米大斑病菌生理小種結構組成與交配型測定

郭建國 楊鳳珍 杜蕙

摘要 為了明確甘肅玉米大斑病菌生理小種與交配型的結構組成，采用單基因鑒別寄主測定了甘肅4個典型生態區57株玉米大斑病菌的抗、感反應型，對峙培養顯微觀測法測定了它們與標準菌株雜交是否產生有性態子囊殼。結果表明，甘肅玉米大斑病菌生理小種結構組成十分復雜，57株病菌中共發現0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N共10個生理小種，0號以61.40%分布頻率成為優勢生理小種，1號以17.54%分布頻率成為次優勢生理小種，23號生理小種出現頻率僅為5.26%、123和N號生理小種出現頻率僅為3.51%，12、1N、2N、3N、123N生理小種出現頻率僅為1.75%，4個典型生態區中河西灌溉綠洲生態區生理小種結構組成最為復雜，15株病菌中共檢出0、1、N、12、1N、2N、3N、123N 8個生理小種，中部干旱雨養、隴東半濕潤半干旱和南部濕潤生態區生理小種結構組成相對簡單，42株病菌共檢出0、1、23、123和N號5個生理小種。相對而言，甘肅玉米大斑病菌交配型結構組成簡單，57株病菌中共檢出A型22株、a型24株， Aa型11株，分布頻率分別為38.6%、42.1%和19.3%；其中河西灌溉綠洲、中部干旱雨養和隴東半濕潤半干旱生態區45株病菌共檢出18株A型、18株a型和9株Aa型，A∶a比例完全符合1∶1，南部濕潤生態區12株病菌共檢出4株A型、6株a型和2株Aa型，A∶a比例小于1∶1。

關鍵詞 玉米大斑病菌； 生理小種； 交配型

中圖分類號： S 435.131.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018066

Abstract To understand the virulence and sexual structure of the causal agent of northern corn leaf blight in Gansu， the reaction types of 57 isolates ofSetosphaeria turcicacollected from Gansu on two sets of differential hosts were tested， and their mating types were also determined by using standard strains. The results showed that their structural composition of natural populations ofS.turcica was complex. A total of 10 races were found in 57 strains， including 0， 1， 12， 23， 123， N， 1N， 2N， 3N and 123N. Race 0 was dominant with a frequency of 61.40%； race 1 was subdominant with a frequency of 17.54%； race 23 accounted for only 5.26%； races 123 and N accounted for 3.51%， and races 12， 1N， 2N， 3N and 123N accounted for 1.75%. The race composition ofS.turcica in irrigated oasis of Hexi was the most complicated： eight races were found in 15 isolates ofS.turcica， including 0， 1， N， 12， 1N， 2N， 3N， and 123N. The structural composition ofS.turcica races in central rainfed drylands， eastern semi-humid and semi-arid regions and southern humid region was comparatively simple in the four typical ecoregions in Gansu： a total of five races were found in 42 isolates ofS.turcica， including 0， 1， 23， 123 and N. In contrast， the structural composition of mating types was very simple： 22 isolates of A type， 24 isolates of a type and 11 isolates of Aa type were detected in 57 isolates， accounting for 38.60%， 42.10% and 19.30%， respectively. Among them， 18 A type， 18 a type and nine Aa type were detected among 45 isolates in the irrigated oasis of Hexi， central rainfed drylands and eastern semi-humid and semi-arid regions， with an approximately 1∶1 proportion of A to a. Moreover， four A type， six a type and two Aa type were detected in 12 isolates from the southern humid region， with a proportion less than 1∶1 of A to a.

Key words Setosphaeria turcica； physiological race； mating type

玉米大斑病（northern corn leaf blight，NCLB）是由有性態大斑剛毛球腔菌Setosphaeria turcica（Luttrell）Leonardet Suggs、無性態大斑凸臍蠕孢Exserohilum turcicum（Pass.）Leonardet Suggs引起的一種以產生大型條形病斑為主的葉枯性病害，在全球冷涼濕潤玉米產區易暴發流行，一般年份減產20%左右，嚴重年份減產50%以上，并會加重玉米根病和莖腐病等病害流行，嚴重影響玉米產量和品質。國內外研究表明，玉米大斑病菌存在寄主分化現象[1]，具有明顯的小種生理分化現象[2]，已報道的有 0、1、2、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、123、12N、13N、23N和123N等16個類型的生理小種，0號和1號小種是當前我國的優勢生理小種[3]。

有性雜交是病菌變異與致病性增強的有效途徑[4]，病菌群體遺傳結構變化是品種抗性喪失的客觀原因[5]。甘肅是中國西部內陸干旱省份，東南至西北降雨量遞減，氣候呈現東南濕潤、中部干旱和西北高寒的特征，玉米種植形成了河西制種與河東高產栽培的兩翼結構，中部和隴東、隴南中晚熟玉米數量較多，生育期偏長[6]。環境條件多樣與物候期延長為該病害發生提供了良好的環境，致使玉米葉部病菌產孢量增加，變異速率加快，侵染循環周期縮短，發生普遍率和嚴重度日益增加，已嚴重影響甘肅玉米的生產安全[7]。為此，本研究于2013—2014年采集了甘肅河西灌溉綠洲、中部干旱雨養、隴東半濕潤半干旱和隴南濕潤生態區的玉米大斑病標樣，室內分離純化后進行了生理小種鑒定與交配型測定工作，旨在明確甘肅玉米大斑病菌生理小種和交配型結構組成，掌握病菌變異方向，制訂該病害的防治策略。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：2013-2014年采集甘肅河西灌溉綠洲（酒泉、張掖和武威）、中部干旱雨養（定西）、隴東半濕潤半干旱（平涼和慶陽）和南部濕潤生態區（天水和隴南）的玉米大斑病樣，帶回室內自來水沖洗干凈晾干后，剪取病健交界處面積為0.5 cm×0.5 cm的葉片4～5塊，于75%乙醇中表面消毒2～3 min后，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸水后置于PDA平板上在25℃條件下光照培養，待菌落產孢后在顯微鏡下挑取單孢進行分離純化，獲得酒泉地區菌株5株、張掖地區5株、武威5株、定西5株、平涼8株、慶陽17株、天水6株、隴南6株，共57株菌株于4℃冰箱保存備用。

鑒別寄主：2套含Ht單基因鑒別寄主分別為Oh43Htl、Oh43Ht2、Oh43Ht3、Oh43HtN和Oh43（對照）及黃早四Htl、黃早四Ht2、黃早四Ht3、黃早四HtN和黃早四（對照）。2013-2014年人工套袋擴大繁殖種子后備用。

交配型標準菌株：A（編號：01～15）和a（編號：01～12）由河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室曹志艷副教授提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉15 g、葡萄糖20 g，補蒸餾水至1 000 mL，滅菌。

Sach培養基：馬鈴薯200 g，K2HPO4 0.25 g，CaCO3 4.0 g，Ca（NO）2 1.0 g，MgSO4 0.25 g，FeCl3 0.02 g，瓊脂11.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，滅菌。

儀器：JA5003精密電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司；1 000～10 000 μL艾本德（Eppendorf）單道可調量程移液器，南京貝登生物科技有限公司；OLYMPUS CX41RF顯微鏡，普赫（上海）光電科技有限公司；MLR-351H多功能人工氣候箱，日本三洋電器集團。

1.2 方法

1.2.1 生理小種測定方法

將鑒別寄主種子經2%次氯酸鈉表面消毒后，于25℃培養箱催芽24 h，萌動后將6粒種子播種于直徑 15 cm裝滿營養土的花盆內，出土后留苗3株。然后將單孢純化的玉米大斑病菌在PDA平板于26℃條件培養10 d進行擴繁，待病菌產生大量分生孢子后加適量無菌水刮洗菌落，雙層紗布過濾除去菌絲碎片，配制成1×105～1×106個/mL的分生孢子懸浮液，滴加1～2滴0.1%吐溫20振蕩搖勻，隔離噴霧接種100 mL于6～8葉期鑒別寄主上，接種后在溫度18～25℃、相對濕度95%塑料棚內保濕48 h后轉入溫室進行正常管理。每隔3 d觀察一次葉片發病狀況，記載病斑出現日期，接種后第14 天參照R型褪綠斑和S型萎蔫斑標準系統調查反應型。鑒定標準[8]為，R型：病斑初為黃綠色水浸狀條斑，后中間部位變褐成窄條形壞死斑，邊緣有明顯較寬的黃色暈圈，病斑狹長，出現早，枯死慢，不產生或很少產生孢子，稱為褪綠斑；S型：病斑初為灰綠色水浸狀斑，后擴大為灰褐色梭形壞死大斑，邊緣無明顯暈圈，出現晚，枯死快，病斑周圍有明顯的萎蔫中毒區，條件適宜時產生大量褐色霉層，稱為萎蔫斑。生理小種命名采用Leonard的命名方法[9]，并參照劉國勝等的毒力標識，小種的毒力公式為有效抗病基因/無效抗病基因[10]，小種描述標準見表1。

1.2.2 交配型測定方法

首先將大麥秸稈剪成8.8 cm長度的小段，經高壓濕熱滅菌后半埋于直徑 90 mm Sach培養基平板中，然后將標準菌株A或a與待測菌株對峙接種[11]于大麥秸稈兩側1.5～2 cm處進行有性雜交誘導。每個待測菌株設6次重復，于25℃培養箱培養4周后顯微鏡下觀察大麥秸稈上是否真正形成了子囊和子囊孢子，產生了子囊殼。玉米大斑病菌為異宗配合真菌，能與A型菌株交配產生子囊殼的為a型菌株，能與a型菌株交配產生子囊殼的為A型菌株，既能與A型又能與a型菌株交配產生子囊殼的為Aa菌株，既不能與A型也不能與a型交配產生子囊殼的為中性菌株[12]。按此原則確定供試菌株交配型。

2 結果與分析

2.1 甘肅玉米大斑病菌生理小種和交配型結構組成

結果表明（表2、圖1和圖2），甘肅玉米大斑病菌自然群體生理小種結構組成總體較為復雜，57株菌株中除未檢測出2、3、13、12N、13N、23N生理小種外，共發現0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N等10個類型生理小種，0號為優勢生理小種，出現頻率高達61.40%，1號為次優勢生理小種，出現頻率為17.54%，23號生理小種出現頻率為5.26%、123和N號生理小種均為3.51%，12、1N、2N、3N、123N生理小種出現頻率均為1.75%。相對而言，甘肅玉米大斑病菌自然群體交配型結構組成十分簡單，57株病菌中未檢測出中性菌株，共檢出A型菌株22株、a型24株， Aa型11株，出現頻率分別為38.60%、42.10%和19.30%，A與a菌株比例接近1∶1。

2.2 甘肅不同生態區玉米大斑病菌生理小種結構組成

結果表明（表2、表3），河西灌溉綠洲生態區生理小種結構組成相對復雜，15株病菌中共檢出0、1、N、12、1N、2N、3N、123N等8個生理小種，0號為優勢生理小種，出現頻率達46.67%，1號為次優勢生理小種，出現頻率為13.33%，12、N、1N、2N、3N、123N號為非優勢生理小種，出現頻率均為6.67%；中部干旱雨養、隴東半濕潤半干旱和南部濕潤生態區生理小種結構組成相對簡單，其中中部干旱雨養生態區5株病菌共檢出0、1和N號3個生理小種，0號為優勢生理小種，出現頻率為60.00%，1號和N號為非優勢生理小種，出現頻率均為20.00%，隴東半濕潤半干旱生態區25株病菌共檢出0、1、23和123號4個生理小種，0號為優勢生理小種，出現頻率為60.00%，1號為次優勢生理小種，出現頻率為20.00%，23和123號為非優勢生理小種，出現頻率分別為12.00%和8.00%，南部濕潤地區12株病菌共檢出0號和1號2個生理小種，0號為優勢生理小種，出現頻率為83.33%， 1號次優勢生理小種，出現頻率為16.67%。

2.3 甘肅不同生態區玉米大斑病菌交配型結構組成

結果表明（表2、表4），河西灌溉綠洲生態區15株病菌中共檢出6株A型、6株a型、3株Aa型，中部干旱雨養生態區5株病菌中共檢出2株A型、2株a型、1株Aa型，隴東半濕潤半干旱生態區25株病菌共檢出10株A型、10株a型和5株Aa型，出現頻率均分別為40.00%、40.00%、20.00%，其中A型和a型菌株出現比例符合1∶1；南部濕潤生態區12株病菌共檢出4株A型、6株a型和2株Aa型，出現頻率分別為33.33%、50.00%和16.67%，其中A型和a型菌株出現比例小于1∶1。

3 討論

玉米大斑病是影響玉米中后期產量形成的一種嚴重葉枯病害，病原隨寄主協同進化中適合度增強是克服品種抗性的重要表現形式。通過監測病原群體遺傳結構的改變，根據病菌的致病性遺傳特征選育抗病品種是該病害控制的一種經濟有效方法，但由于病原菌菌絲體普遍呈現多核現象，不同細胞核均能發育成單個菌體[3-14]，這種自然現象不僅有利于保持病菌群體的遺傳多樣性，而且使病菌種群結構組成易受生境影響出現新的致病小種[15]。甘肅生態環境復雜、玉米種植結構多樣，境內4大典型生態氣候區和兩翼種植結構易使大斑病菌群體結構組成多元化。本研究發現甘肅玉米大斑病菌群體結構組成較為復雜，57株菌株中共出現0、1、12、23、123、N、1N、2N、3N、123N 10個生理小種，0號以高頻率分布成為優勢生理小種，1號為次優勢生理小種，4個典型生態區中河西制種玉米大斑病菌結構組成十分復雜，15株病菌中共出現0、1、N、12、1N、2N、3N、123N 8個生理小種，中部干旱雨養、隴東半濕潤半干旱和南部濕潤生態區普通玉米病菌結構組成相對簡單，42株病菌共出現0、1、23、123和N號5個生理小種，這一研究結果與前人研究結果基本一致[16-17]，說明品種選擇是病原群體結構多元化的內在影響因子[18-19]，氣候環境是優勢生理小種流行的外在因素[20]，多品種組合持續選擇易使病原群體結構復雜化[21]，單一或簡單組合易使優勢小種大流行[22]，123N復合型致病性生理小種的出現今后將嚴重威脅著Ht基因骨干自交系的利用[23]。

有性生殖是異宗配合病菌致病性變異的一種重要途徑[24]，該過程易使具有親和交配型菌株的毒性基因疊加或重組產生新的致病類群[25]，有利于拓寬病菌致病寄主范圍，增強病害流行風險性[26]。本研究發現，甘肅57株玉米大斑病菌中除未發現中性菌株外共檢出A型22株、a型24株， Aa型11株，4個典型生態區中河西灌溉綠洲、中部干旱雨養和隴東半濕潤半干旱生態區45株病菌共檢出18株A型、18株a型和9株Aa型，A∶a比例符合1∶1，南部濕潤生態區12株病菌共檢出4株A型、6株a型和2株Aa型，A∶a比例小于1∶1，該研究結果與我國東北、華北和西南玉米大斑病菌交配型監測結果基本一致[27]，說明甘肅玉米大斑病菌的交配變異在地理尺度上具有一定相似性，河西灌溉綠洲、中部干旱雨養和隴東半濕潤半干旱3個典型生態區病菌致病性的變異是由A型與a型按1∶1比例以及Aa型與A型或a型按1∶2比例的有序交配形成的，而南部濕潤地區病菌致病性的變異是由A型與a型按2∶3比例以及Aa型與A型按1∶2比例或Aa型與a型按1∶3比例有序交配形成，不同生態區Aa型菌株所占比例很可能是病原群體結構差異的根源。因此，針對不同生態類型多樣和兩翼種植結構，如何穩定或降低玉米品種對大斑病菌選擇壓力、延緩病菌生理分化速率、延長品種壽命或組合開發廣譜抗性品種是今后共同關注的課題。

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（責任編輯：田 喆）