地衣芽胞桿菌HS10原生質電轉化體系的研究

徐龍　黃文祥　劉紅霞

摘要

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白對多種病原真菌具有防治效果，為挖掘其生防功能基因，本研究通過對原生質體的制備、再生培養基、滲透壓穩定劑、電擊參數等試驗條件進行優化，建立了地衣芽胞桿菌HS10原生質體電轉化法。結果表明最佳轉化條件為：轉接培養10 h達到對數生長后期的菌體，濃縮4倍后，利用終濃度1 mg/mL的溶菌酶，于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解效率達到99.34%，1×SMM洗滌3次，調整菌濃度至1.0×108 cfu/mL，并通過1.6 kV、5 ms的電擊后，迅速在SMMP溶液中100 r/min、37℃恢復6～10 h，涂布于含Kan和Erm的再生培養基DM3平板。將該方法用于突變體庫構建的質粒pMarA（8 253 bp）和基因敲除質粒pMADΔCP（13 043 bp）的大片段質粒轉化，分別獲得了37 cfu/μg DNA和10 cfu/μg DNA 陽性轉化子。該遺傳轉化體系為地衣芽胞桿菌HS10中相關基因功能的研究提供了技術支撐。

關鍵詞

地衣芽胞桿菌； 原生質體； 電轉化； 質粒

中圖分類號：

Q 785

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017301

Studies on the electroporation system for Bacillus licheniformis

HS10 protoplast

XU Long， HUANG Wenxiang， LIU Hongxia

（College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Bacillus licheniformis HS10 and its crude protein have good effects on various pathogenic fungi. In order to identify the functional genes， genetic manipulation is needed. Though the optimization of the protoplast preparation， regeneration medium， osmotic stabilizer， shock conditions and other experimental conditions， the electroporation method of protoplast was set up in this paper. The experimental results showed that the optimum reaction conditions were as followed： The cells at logarithmic growth period after transferred for 10 h were concentrated by 4 times， and then subjected to enzymolysis for 20 min with a final concentration of 1 mg/mL lysozyme at 37℃ and 150 r/min. Enzymolysis rate reached 99.34%. The products of enzymolysis were washed for three times with 1× SMM and adjusting the concentration to 1.0×108 cfu/mL. After electroporation at 1.6 kV and 5 ms， with 0.5 mol/L sucrose as osmotic stabilizer， the cells were quickly restored for 6-10 h in SMMP solution， then coated on DM3 resistant plate. In the largefragment transformation using the plasmids pMarA （8 253 bp） and pMADΔCP（13 043 bp）， we obtained 37 cfu/μg DNA and 10 cfu/μg DNA positive transformants. This study established a genetic transformation system for the genetic manipulation of Bacillus licheniformis HS10.

Key words

Bacillus licheniformis； protoplast； electroporation； plasmid

地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis具有完善的蛋白表達系統、豐富的代謝產物以及對多種病原微生物具有拮抗能力的優勢，被廣泛應用于病害生物防治、蛋白酶工業、工業發酵領域[12]。已有研究表明：地衣芽胞桿菌對農作物的真菌性病害，如灰霉病[3]、油菜菌核病[4]、柑橘炭疽病及蘋果輪紋病[5]等有較好的防治效果。因此，地衣芽胞桿菌是最具應用開發潛力的芽胞桿菌之一。

Bacillus licheniformis HS10分離于黃瓜根際，對黃瓜霜霉病的田間防效達到40%～60%，Wang等發現該菌株及其蛋白粗提取物對小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、小麥根腐病菌Bipolaris sorokiniana等多種病原真菌均具有拮抗作用，通過對其粗蛋白進行純化分析和GCMS鑒定，發現起拮抗作用的是類羧肽酶蛋白[6]。為深入探究該菌株防病抑菌機理，挖掘功能基因，需要對菌株進行基因水平的遺傳操作。

野生地衣芽胞桿菌轉化技術多借鑒枯草芽胞桿菌，已報道的轉化方法主要有原生質轉化法[7]和電轉化法[8]。但由于感受態形成缺陷、限制性修飾系統、菌株差異等特性，使得菌株轉化較為困難[910]。我們前期試驗中嘗試了化學轉化、電轉化、原生質轉化法，以及溫賽等[11]提出的原生質電轉化法，均未獲得陽性轉化子。

針對該問題，本研究利用正交試驗優化了原生質體制備中各影響因素，分析確定了最適酶解條件，并針對原生質體的滲透壓穩定劑、恢復條件、電擊條件等因素進行了摸索，實現了用于突變體庫構建的pMarA（8 253 bp）質粒和用于基因敲除的pMADΔCP （13 043 bp）大片段重組質粒的轉化。建立了地衣芽胞桿菌HS10轉化體系，為后續深入機理探究、工程菌株構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

Bacillus licheniformis HS10、DH5α為本實驗室保存。pMarA質粒為高學文教授課題組饋贈。pMAD載體[12]為本實驗室保存，pMADΔCP為本實驗室構建的，用于HS10中類羧肽酶基因的敲除質粒。

1.1.2 試劑

溶菌酶（lysozyme）購于Sigma公司。取1 g用菌體保護液SMMP溶解，定容至10 mL，配制成100 mg/mL，并使用0.22 μm濾器除菌，-20℃分裝保存。卡那霉素（Kan）和紅霉素（Erm）購于南京鼎思生物科技公司。卡那霉素用ddH2O溶解配制成50 mg/mL，過0.22 μm濾器除菌；紅霉素用無水乙醇溶解配制成5 mg/mL，過0.22 μm濾器除菌。

LB：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L NaCl，pH 7.2，15 g/L瓊脂；SOB培養基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，0.5 g/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2；SOC培養基：SOB中添加20 mmol/L葡萄糖。

4×PAB：6 g/L牛肉膏，6 g/L酵母浸粉，20 g/L胰蛋白胨，19.3 g/L K2HPO4·3H2O，5.3 g/L KH2PO4，14 g/L NaCl，120℃滅菌，加50%葡萄糖8 mL。

2×SMM：4.6 g/L馬來酸（順丁烯二酸），8.1 g/L MgCl2·6H2O，pH 6.5，滅菌后加入終濃度為1 mol/L蔗糖。1×SMM：2×SMM與dd H2O等體積混勻。

菌體保護液SMMP：4×PAB與2×SMM等體積混合后加入2%BSA（注：2×SMM含有1 mol/L蔗糖，因此SMMP中蔗糖終濃度為0.5 mol/L，即以0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩定劑）；其他菌體保護液：分別用終濃度為0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇、10%甘油、0.5 mol/L海藻糖、1 mol/L琥珀酸鈉、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖或0.75 mol/L甘露醇代替0.5 mol/L的蔗糖作為SMMP的滲透壓穩定劑，其他組分不變，配制成含不同穩定劑的菌體保護液。

DM3再生培養基：5 g/L水解酪蛋白，1.5 g/L KH2PO4，4.6 g/L K2PO4·3H2O，162.05 g/L琥珀酸鈉，10 g/L淀粉，5 g/L酵母浸粉，8 g/L瓊脂，5 g/L葡萄糖，0.09 g/L BSA，0.02 mol/L MgCl2，（葡萄糖、MgCl2單獨滅菌后加入）；RD再生培養基：1 g/L （NH4）NO3，3.5 g/L K2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，81 g/L琥珀酸鈉，5 g/L明膠，4.07 g/L MgCl2·6H2O，5 g/L葡萄糖，8 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌體生長曲線的測定

使用LB平板活化超低溫保存的地衣芽胞桿菌HS10，于37℃培養1 d，挑取單菌落接種于含LB試管中，37℃、200 r/min培養12 h后，按1%接種量轉接至100 mL LB中（250 mL三角瓶）繼續培養，每小時取樣，檢測培養物OD600，記錄分析。

1.2.2 HS10原生質體的制備

挑取轉接培養4、6、8、10 h的菌體，離心收集菌體并用1/4體積SMMP重懸，使用終濃度1 mg/mL的溶菌酶于37℃處理20 min，獲得原生質化的HS10菌體。酶解后直接稀釋涂布LB平板計數，以未酶解處理的對照作總菌量。

原生質體形成率=[1-（酶解后菌量/總菌量）]×100%。

1.2.3 HS10原生質體的再生與恢復

由上述方法制備的原生質體，使用含有0.5 mol/L蔗糖的SMMP恢復培養4 h，涂布相應平板，檢測各滲透壓穩定劑下菌體恢復情況。

1.2.4 HS10原生質體的電轉化與恢復

將制備好的原生質體于4℃，5 000 r/min離心10 min，使用預冷的1×SMM溶液反復漂洗3次，之后使用1×SMM重懸，調整菌濃度為1.0×108cfu/mL。將原生質體以100 μL分裝，電擊前加入4 μL 250 ng/μL pMarA質粒混勻（即1 μg質粒），置于冰上5 min后，使用預冷的2 mm電擊杯，設置1.6～2.5 kV，5 ms，進行電擊轉化，電擊后迅速加入1 mL預冷的SMMP恢復培養液，于37℃，100 r/min培養6～10 h后，涂布于含卡那霉素Kan （10 mg/mL）和紅霉素Erm（5 mg/mL）的固體DM3培養基上。每個試驗重復3次。（電擊儀使用Eppendorf的Multiporator多功能細胞電穿孔儀，電阻為系統設定值）。

1.2.5 質粒的提取和細菌基因組DNA提取

菌體質粒的提取參照AxyPrep小量質粒提取試劑盒APMNP250的使用說明。地衣芽胞桿菌基因組DNA提取參照Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒DP30202的使用說明。

1.2.6 陽性轉化子的驗證

利用pMarA構建地衣芽胞桿菌HS10隨機突變體庫的方法，以及陽性轉化子的驗證所使用的引物oTNP1和oTNP2參考Le Breton等[13]，引物kanF和kanR為本實驗室設計。

轉化子的PCR驗證參考TaKaRa的rTaq酶產品說明，程序為95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，72℃ 10 min。酶切驗證參考TaKaRa限制性內切酶產品說明。

1.2.7 試驗統計分析

數據使用DPS 7.05軟件進行單因素方差分析，LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

不同菌齡的菌體其生長狀態、胞內外合成物質、對外界條件的敏感性均存在差異。對HS10進行生長曲線測定（圖1），可以看到：當按1%菌量，37℃、200 r/min轉接培養4 h后，菌體開始進入對數生長期，10 h后達到對數生長后期，之后進入穩定期。

2.2 HS10原生質體制備最佳條件正交試驗

對不同試驗條件下原生質體的形成情況進行分析，結果表明，地衣芽胞桿菌原生質體制備過程中最為重要的影響因素是溶菌酶濃度。在0.1 mg/mL的濃度下，原生質體的形成率，即酶解效率多為80%以下，而1 mg/mL濃度下能達到95%以上，但隨著溶菌酶濃度的繼續增加，原生質體的形成率并沒有明顯差異（表2）。同時，原生質體的形成率隨著菌齡的增加而增加，表明隨著菌體的成熟，其對溶菌酶也越來越敏感。為保證獲得足夠多的原生質體，又不至于由于使用過高的溶菌酶濃度和酶解時間導致菌體的再生恢復能力降低，并考慮到后續試驗中菌量和滲透壓穩定劑等因素，最終選擇HS10最佳酶解條件為：轉接培養10 h，將菌體濃縮4倍后，使用1 mg/mL終濃度的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，以此獲得最佳原生質體。

2.3 HS10原生質體最佳恢復條件

進一步分析滲透壓穩定劑對原生質體再生的影響可知，按上述優化的酶解條件，酶解并恢復4 h后，以0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩定劑，恢復的菌體量最大，能夠達到8.5×107cfu/mL，隨后依次是0.5 mol/L甘露醇（7.4×107 cfu/mL）、10%甘油（6.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L山梨醇（6.7×107 cfu/mL）、0.5 mol/L海藻糖（6.2×107 cfu/mL）、1 mol/L琥珀酸鈉（5.8×107 cfu/mL）、0.5 mol/L蔗糖+0.5 mol/L海藻糖（4.0×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.38 mol/L山梨醇（2.9×107 cfu/mL）、0.5 mol/L甘露醇+0.5 mol/L海藻糖（1.7×107 cfu/mL）、0.75 mol/L甘露醇（1.5×107 cfu/mL）（圖2）。

由試驗結果可以看出，過高濃度滲透壓穩定劑并不有利于菌體的恢復再生，再生的菌量甚至低于SMMP（H2O）條件，同時可以看出，在無滲透壓穩定劑的條件下，依然有大量的菌體恢復擴增，甚至優于過高滲透壓條件。故在后續的電擊試驗和菌體恢復中，采用0.5 mol/L蔗糖作為滲透壓穩定劑。

將SMMP溶液中恢復的菌體稀釋涂布于不同的培養基中，可以看出：DM3由于其營養豐富，最有利于菌體細胞壁的再生和恢復，而LB、SOB、SOC培養基并不是最佳選擇（圖3）。同時相較于RD培養基，DM3中菌體的恢復量高于RD再生培養基，菌體在平板上生長也更加圓潤和健康，因此選擇DM3作為再生培養基。

2.4 電擊強度對HS10原生質體轉化的影響

本研究采用瞬間電擊實現原生質體的轉化，此過程對原生質體的傷害會影響原生質體的恢復再生，過低的電壓無法產生合適的穿孔，而過高的電壓又會導致菌體大量死亡。由圖4可以看出，原生質體在電擊并恢復4 h后，恢復的菌量隨電擊強度的增強而減少，菌量依次為：1.6 kV時1.9×107 cfu/mL、2.0 kV時1.0×107 cfu/mL、2.5 kV時7.0×106 cfu/mL。原生質體對電擊強度較敏感，原生質體受到的傷害隨著電擊強度增加而增加。因此選擇較低的1.6 kV的電壓更為合適。

電壓優化試驗顯示，原生質體在不同電壓條件下獲得的轉化子數分別為：0.8 kV時7 cfu/μg DNA、1.2 kV時21 cfu/μg DNA、1.6 kV時37 cfu/μg DNA、2.0 kV時18 cfu/μg DNA、2.5 kV時9 cfu/μg DNA（圖5）。原生質體在1.6 kV電壓條件下獲得轉化子數最多。1.6 kV以下，電壓與轉化效率呈正比，1.6 kV以上呈反比。可能原因為過強的電壓條件會導致部分菌體受傷嚴重，無法進行菌體細胞壁再生恢復，或菌體恢復較慢，導致在涂布抗生素平板后，菌體無法生長。由此可知最佳的電擊條件為1.6 kV，5 ms。

2.5 質粒大小對HS10原生質體轉化的影響

在此之后，又對該菌株進行了更大質粒的電擊轉化。轉化質粒為pMADΔCP，質粒大小為13 043 bp。結果顯示質粒大小對轉化效率有一定影響，pMADΔCP質粒轉化子顯著少于pMarA質粒（表3）。

2.6 陽性轉化子的驗證

將穿梭載體pMarA、pMADΔCP轉化入HS10中，挑取轉化子提取質粒，對質粒進行PCR和酶切驗證。結果如圖6所示：用Kpn I分別對pMarA和HS10pMarA質粒酶切后，都形成了2個大小為1.5 kb和6.5 kb的片段，PCR擴增pMarA和HS10pMarA質粒中的Himar 1轉座酶基因，都得到長度為1.5 kb的片段，擴增TnYLB1中的Kan基因，都形成了370 bp的片段。在對pMADΔCP質粒的檢測中，使用BgI II/Nco I雙酶切，均能產生3 600 bp的片段。上述結果表明：pMarA、pMADΔCP質粒已成功轉入地衣芽胞桿菌HS10菌株中。

提取突變體菌株的基因組，擴增轉座子TnYLB1中的Kan片段，由圖7可以看出，隨機挑選的15個突變體基因組中均含有370 bp大小的片段，證實TnYLB1成功插入到HS10基因組中。

3 討論

地衣芽胞桿菌已報道的轉化方法主要有“原生質轉化法”和“高滲透電轉化法”[78]。聚乙二醇介導的原生質轉化法的原理是聚乙二醇能夠黏合細胞、擾亂細胞膜雙分子層，并能夠吸附溶液中的水分子使外源DNA和細胞膜形成分子橋，促進相互之間的接觸連接，從而導入外源DNA實現轉化[1415]。高滲透電轉化法則是利用瞬間電壓實現電穿孔，從而利于外源質粒導入菌體。前者反應較為溫和，后者存在細胞壁阻礙，在二者均無法成功轉化時可選擇原生質體電轉化法，在打破細胞壁阻礙的同時，利用電穿孔增加外源DNA導入菌體的機會，使得轉化更為高效可行。但該法較為繁瑣，需要對原生質體的制備、電擊條件、原生質體的恢復再生等條件進行優化才能達到最佳的轉化效率[10]。

在原生質體制備中，除菌體生長狀態外，溶菌酶濃度、酶解時間、酶解溫度也是重要影響因素[7]。溶菌酶濃度過高、時間太長均會導致脫壁太徹底，不利于菌體的再生恢復，而溶菌酶濃度過低、時間太短，又會因酶解不徹底而影響轉化。溫賽等對影響酶解的條件進行了單因素逐一分析[10]，本論文選用4因素4水平的正交試驗進行原生質體制備的優化，并得出最佳條件為：取對數生長后期菌體，濃縮4倍后使用終濃度1 mg/mL的溶菌酶于37℃、150 r/min酶解20 min，酶解率達到99.34%。優化后的條件及研究方法對其他野生地衣芽胞桿菌原生質體的制備具有參考價值。

電擊后的恢復培養是受傷的菌體恢復再生的重要時期，酶解液、電擊緩沖液、恢復培養液均需使用合適的滲透壓穩定劑，以維持受損細胞的形態，避免吸水脹破。Junichi等報道稱，無機鹽作為滲透壓更有利于原生質體的形成，但糖醇類物質更有利于原生質體的再生[1617]。試驗得出0.5 mol/L蔗糖最有利于HS10菌體的恢復，0.5 mol/L甘露醇僅次于0.5 mol/L的蔗糖。需要指出的是：該結果不能等同于原生質在不同滲透壓穩定劑下的恢復率，因為原生質體在4 h的恢復過程中，存在菌體的擴增，包括未原生質化菌體和再生菌體的擴增。在電壓條件優化方面，選擇1.6 kV，5 ms進行電轉化能降低對菌體的傷害，又能保證較高的轉化效率。優化的滲透壓穩定劑和電轉化條件對其他野生地衣芽胞桿菌的轉化具有借鑒意義。不足之處在于，只對pMarA質粒的轉化進行了電壓摸索和優化，未能在更大片段的pMADΔCP（13 043 bp）質粒的轉化中進一步優化電壓。

在對不同野生菌株進行轉化時，會因為各種原因導致轉化失敗，例如：原生質體制備不佳、滲透壓穩定劑不合適、電轉電壓過高導致死亡、電壓過低無法形成很好的穿孔、菌體恢復時間過短、菌體洗滌不干凈導致擊穿、菌濃度過高導致電擊效率不佳，甚至操作時間過長等。因此，在實際操作中，應視情況做相應的調整。綜上，本試驗通過對野生地衣芽胞桿菌HS10原生質體制備、電轉化、恢復等過程進行了優化，成功實現了高效率的轉化，為后續地衣芽胞桿菌HS10基因改造、防病機理的探究等打下基礎。

參考文獻

[1] 牛丹丹， 石貴陽， 王正祥. 分泌高效蛋白的地衣芽胞桿菌及其工業應用[J]. 生物技術通報， 2009（6）：4550.

[2] 孫倩， 陳復生， 丁長河， 等. 地衣芽胞桿菌產堿性蛋白酶發酵條件優化[J]. 食品工業科技， 2012，33（13）：174177.

[3] 童蘊慧， 郭桂萍， 徐敬友， 等. 拮抗細菌對番茄植株抗灰霉病的誘導[J]. 中國生物防治， 2004（3）：187189.

[4] 孫啟利， 陳夕軍， 童蘊慧， 等. 地衣芽胞桿菌W10抗菌蛋白對油菜菌核病菌的抑制作用及防病效果[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版）， 2007（3）：8286.

[5] 紀兆林，童蘊慧，凌箏，等.拮抗細菌對部分水果產后病原真菌的抑制及防腐作用[J].金陵科技學院學報，2003（4）：2327.

[6] WANG Z， WANG Y， ZHENG L， et al. Isolation and characterization of an antifungal protein from Bacillus licheniformis HS10 [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014，454（1）：4852.

[7] 莫靜燕， 陳獻忠， 王正祥. 地衣芽胞桿菌原生質體的制備、再生及轉化研究[J]. 生物技術， 2009，19（5）：7577.

[8] ROMERO D， PEREZGARCIA A， VEENING J W， et al. Transformation of undomesticated strains of Bacillus subtilis by protoplast electroporation[J]. Journal of Microbiological Methods， 2006，66（3）：556559.

[9] SUGA M， KUSANAGI I， HATAKEYAMA T. High osmotic stress improves electrotransformation efficiency of fission yeast [J].FEMS Microbiology Letters，2003，225（2）：235239.

[10]WASCHKAU B， WALDECK J， WIELAND S， et al. Generation of readily transformable Bacillus licheniformis mutants [J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008，78（1）：181188.

[11]溫賽，楊建國. 地衣芽胞桿菌原生質體電轉化方法的研究[J]. 中國生物工程雜志， 2015，35（7）：7682.

[12]ARNAUD M， CHASTANET A. DEBARBOUILLE M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable， lowGCcontent， grampositive bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70（11）：68876891.

[13]LE BRETON Y， MOHAPATRA N P， HALDENWANG W G. In vivo random mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB1， a marinerbased transposon [J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006，72（1）：327333.

[14]MAAS C， WERR W. Mechanism and optimized conditions for PEG mediated DNA transfection into plant protoplasts[J]. Plant Cell Reports， 1989，8（3）：148151.

[15]ZHANG X Z， ZHANG Y. Simple， fast and highefficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis [J]. Microbial Biotechnology， 2011，4（1）：98105.

[16]陳乃用，印小明. 芽胞桿菌原生質體的形成和質粒轉化的研究[J]. 微生物學報， 1986，26（2）：134142.

[17]JUNICHI S， TAKASHI A. Studies on regeneration media for Bacillus subtilis protoplasts[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1981， 45（12）：28872894.

（責任編輯：楊明麗）