核桃枝枯病小新殼梭孢巢式PCR檢測方法的建立

陳杰　朱天輝

摘要

近年來，小新殼梭孢Neofusicoccum parvum導致的核桃枝枯病屢有報道，該病防治困難，發病率高，是核桃的一種災難性病害。為建立N.parvum的快速、靈敏的分子檢測體系，根據N.parvum的幾丁質合酶1基因（CHS1）及其前后100 bp序列，分別設計了兩對特異性引物CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA，建立了N.parvum的巢式PCR檢測方法。結果表明，建立的體系可以從不同來源的5個N.parvum菌株中特異性地擴增出97 bp的目的條帶，靈敏度達30 fg/μL，是常規PCR的10倍，而從其近緣種葡萄座腔菌屬Botryosphaeria sp.的病原菌及其他供試菌株均未擴增出任何條帶。以感染N.parvum的核桃組織總DNA為模板進行檢測，可以在發病早期檢測出N.parvum的存在。本研究建立的巢式PCR體系可以為核桃枝枯病的田間檢測提供思路。

關鍵詞

核桃枝枯病； 小新殼梭孢菌； 分子檢測； 巢式PCR

中圖分類號：

S 763.13

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017262

Establishment of nested PCR method for detecting the branch dieback of

walnut caused by Neofusicoccum parvum

CHEN Jie， ZHU Tianhui

（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang 611130， China）

Abstract

The branch dieback of walnut caused by Neofusicoccum parvum has repeatedly been reported in recent years. The disease is a catastrophic disease of walnut with high incidence and is difficult to control. In order to establish a rapid and sensitive molecular detection system for N.parvum， two pairs of specific primers， CTWK3S / CTWK3A and CTNS / CTNA， were designed according to the sequence of chitin synthase 1 （CHS1） of N.parvum and 100 bp flanking sequences， and a nested PCR detection assay was established for N.parvum. The results showed that the established assay was specific to five strains of N.parvum from different sources and could amplify a 97 bp target with a sensitivity of 30 fg/μL， which was 10 times more sensitive than conventional PCR. No products were amplified in the related pathogenic species， Botryosphaeria sp.， as well as the other tested strains. Therefore， the total DNA of walnut infected by N.parvum can be used as a template to detect the presence of N.parvum early in the disease. The nested PCR system established in this study can provide ideas for field detection of walnut branch dieback.

Key words

walnut blight； Neofusicoccum parvum； molecular detection technology； nested PCR

據統計，目前我國核桃栽培面積達554.78萬hm2，占全國經濟林總面積的14.96%，比2002年增加464.91萬hm2，有10個省（自治區）的種植面積在10萬hm2以上[1]。與此同時，核桃的各類病蟲害也日益頻發，其中核桃枝枯病在全國各地均有發生。引起核桃枝枯病的病原菌已報道的有矩圓黑盤孢Melanconium oblongum[24]、胡桃黑盤孢M. juglandina[56]、胡桃楸擬莖點霉Phomopsis juglandina[7]、莖生擬莖點霉P.truncicola[8]和小新殼梭孢Neofusicoccum parvum[910]。目前國內外研究較多的是M.oblongum，而對其他引起核桃枝枯病的病原菌則研究較少。2013年，Cheon等首次報道了N.parvum在韓國引起核桃枝枯病[11]，而后該病原菌引起的核桃枝枯病陸續又在我國山西和四川有過報道[1213]。

小新殼梭孢Neofusicoccum parvum屬子囊菌門Ascomycota，子囊菌綱Ascomycetes，假球殼目Pleosporales，葡萄座腔菌科Botryosphaericeae，新殼梭孢屬Neofusicoccum，在田間主要借風、雨或昆蟲傳播，并可通過自然孔口或機械損傷等侵染枝條[14]。

近年來已發展了多種植物病原菌的分子檢測技術，其中巢式PCR擴增技術是由內外兩對引物先后對靶序列進行擴增，使其DNA拷貝數以雙重指數級增加，因而靈敏度也大幅度提高。該技術已被廣泛應用于多種植物病原菌的分子檢測，如荔枝霜疫霉[15]、菜豆暈疫病菌[16]、甘蔗黑穗病菌[17]、琯溪蜜柚黑斑病菌[18]、向日葵白銹病菌[19]等。

目前，國內外關于核桃枝枯病分子檢測技術的研究鮮有報道。本研究根據N.parvum的CHS1基因及其前后100 bp序列設計特異性內、外引物，擬建立一種快速、靈敏的巢式PCR檢測體系，為我國核桃枝枯病早期防治提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：供試菌株詳細信息見表1。

引物：采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0，根據GenBank中公布的N.parvum的CHS1和基因組序列，設計兩對特異性引物，即：外引物：CTWK3S（5′GTGTCTATCAGGACGGCATTG3′）/CTWK3A（5′CGAGGACGGTTCCAAAGG3′）預計擴增片段大小為271 bp和內引物CTNS（5′GGACGGCATTGCCAAGCA3′）/CTNA（5′TTAGCGTCTTTCCACGGGTCTT3′），預計擴增片段大小為97 bp。引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）：煮熟馬鈴薯濾液200 g/L，葡萄糖20 g/L；LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。固體培養基為在對應液體培養基中加15～20 g/L瓊脂粉。

試劑及儀器：離心柱型植物基因組提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit DP305）、DL2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、2×Taq PCR Master Mix （KT201）及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；大腸桿菌菌株Escherichia coli DH5α購自北京全式金生物技術有限公司；pMD19T載體購自寶生物工程有限公司；50×TAE Buffer購自索萊寶科技有限公司；西班牙瓊脂糖，BIOWEST公司生產；Gold ViewⅠ核酸染色劑購自索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制備

菌株培養：用打孔器從接菌7 d的PDA平板中取直徑5 mm的菌餅接種于裝有滅菌PDB的錐形瓶中，28℃恒溫140 r/min振蕩培養5 d。

菌絲獲取：菌絲的獲取參照何月秋[20]的方法，置于冰箱-20℃保存待用。

核桃發病組織獲取：用針刺法在健康兩年生核桃植株的枝條上接種N.parvum菌餅，用無菌水噴濕后覆蓋保鮮膜置于室外通風處，隨后觀察發病情況。在核桃枝枯病發病時期分不同發病情況（表2）用消毒后的刀片采集接種枝條的韌皮部，對樣品進行表面消毒后置于冰箱-80℃保存待用。

DNA的提取：核桃樣品組織DNA提取參照天根植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Extraction Kit）說明書；供試菌株DNA提取參照劉少華等[21]的方法。用Biomate 3S紫外可見核酸蛋白分析儀測定吸光值，估算DNA的質量和濃度后置于-20℃保存待用。

1.2.2 PCR擴增體系

常規PCR擴增體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L外引物（或內引物）各 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，用雙重蒸餾水補足至50 μL。程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸20 s，33個循環；最后72℃延伸8 min。

巢式PCR擴增體系：以外引物進行第一輪PCR，擴增體系同常規PCR，擴增程序除退火溫度改為53℃和延伸時間改為30 s外其他同常規PCR。取第一輪產物稀釋10倍后，以內引物進行第二輪擴增，體系和程序同常規PCR。

電泳檢測：4%的瓊脂糖凝膠，110V電壓下電泳40 min。

1.2.3 巢式PCR引物退火溫度的篩選

以外引物和內引物分別擴增N.parvum基因組DNA，退火溫度梯度設置為45～55℃，其他程序及體系同1.2.2常規PCR。

1.2.4 巢式PCR引物特異性驗證

用引物對CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA對所有供試菌株基因組DNA進行巢式PCR擴增，體系及程序見1.2.2巢式PCR。

1.2.5 PCR產物的克隆及序列分析

用引物對CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA對N.parvum基因組DNA進行巢式PCR擴增，產物電泳后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化、克隆至pMD19T載體中，并轉化至DH5α感受態細胞中，取100 μL涂平板，37℃培養過夜，隨即挑取單菌落接種到LB培養基中，37℃振蕩培養4 h，用菌液PCR篩選陽性克隆，隨機選擇3個陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。將得到的產物序列經NCBI在線BLAST比對驗證其來源，再用DNAMAN分析其與目的片段的一致性。

1.2.6 巢式PCR靈敏度試驗

用特異性引物對CTNS/CTNA和CTWK3S/CTWK3A分別對濃度為300 ng/μL、30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL的N.parvum基因組DNA進行常規PCR擴增和巢式PCR擴增，設置無菌ddH2O為陰性對照，擴增體系及程序同1.2.2。

1.2.7 發病組織檢測

以1.2.1中不同發病等級的核桃組織及健康核桃組織的DNA作為模板，分別進行CTWK3S/CTWK3A常規PCR、CTNS/CTNA常規PCR和巢式PCR，擴增體系及程序同1.2.2。

2 結果與分析

2.1 巢式PCR引物退火溫度優化

以外引物CTWK3S/CTWK3A進行擴增時，不同退火溫度下擴增N.parvum基因組DNA的結果見圖1，結果表明該對引物在退火溫度45～55℃時均能很好地擴增出目的條帶，且無雜帶產生。為了保證擴增產物的產量和引物的特異性，最終選擇55℃作為該對引物的退火溫度。以內引物CTNS/CTNA進行擴增時，不同退火溫度下擴增N.parvum基因組DNA的結果見圖2，結果表明該對引物在退火溫度45～55℃均能擴增出目的條帶，但均有非目的性條帶產生。為了使引物的特異性最佳，最終選擇53℃作為該對引物的退火溫度。

2.2 巢式PCR特異性檢測

外引物對CTWK3S/CTWK3A常規PCR擴增結果見圖3，5個不同來源的N.parvum均擴增出了非常明亮的271 bp的目的條帶，但其他菌株也都有微弱非特異性目的條帶出現。內引物對CTNS/CTNA常規PCR擴增結果見圖4，5個不同來源的N.parvum均擴增出了不甚明亮的97 bp的目的條帶，但葡萄座腔菌屬Botryosphaeria的3個菌株（圖4，泳道6～8）可見一條約500 bp的微弱非特異性目的條帶，其他10個菌株均無條帶出現。巢式PCR檢測結果見圖5，5個不同來源的N.parvum均擴增出了97 bp的特異性目的條帶，而其他18個菌株均無條帶出現。

2.3 巢式PCR靈敏度檢測

用內側特異性引物對CTNS/CTNA進行常規PCR，能檢測到300 fg/μL的N.parvum總DNA（圖6），而用外側引物對CTWK3S/CTWK3A的PCR產物稀釋10倍作為模板，再用內引物對CTNS/CTNA進行巢式PCR能檢測到30 fg/μL的N.parvum總DNA（圖7）。表明巢式PCR靈敏度是常規PCR的10倍。

2.4 測序結果

陽性產物克隆測序后在NCBI數據庫進行在線BLAST對比分析，結果表明，本試驗選取的3個陽性克隆的序列與N.parvum CMW9071菌株（GenBank登錄號為EU339498.1）、MUCC211菌株（GenBank登錄號為EU339500.1）和CMW7772菌株（GenBank登錄號為EU339495.1）的序列一致性達100%，100%和99%，用DNAMAN軟件包分析比對表明，序列與巢式PCR預測產物一致。

2.5 核桃發病組織檢測

不同發病情況的組織及健康組織DNA分別以CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA進行常規PCR檢測和巢式PCR檢測，結果見圖8。兩對引物的常規PCR均只能檢測出3級、2級和1級發病組織內病原菌，其中CTWK3S/CTWK3A還擴增出了約850 bp的明顯雜帶，而巢式PCR可以檢測出4級、3級、2級、1級和0級發病組織，且呈單一條帶，表明其靈敏度和特異性都明顯高于常規PCR。

3 討論

一種高特異性、高靈敏度的分子檢測方法能否成功建立，關鍵在于靶序列的選擇。目前，已報道的分子檢測技術常用靶序列主要有核糖體RNA基因的內轉錄間隔區（ITS）[22]、細胞骨架蛋白（betatubulin）基因[23]、肌動蛋白（actin）[24]基因、水稻抗稻瘟病基因（Pi）[25]、轉錄延伸因子（factor 1alpha）[26]、 熱激蛋白（heat shock protein）基因[27]、線粒體NADH脫氫酶基因（NADH 1）[28]、RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基基因（RPB2）[29]等。眾所周知，不同物種的基因保守序列不同，同一物種的同一基因變異程度也不同，而植物病原菌作為典型的R策略者，其種群增長率大，種內遺傳多樣性豐富，所以尋找一個合適的分子檢測靶基因并不是一件輕而易舉的事。

幾丁質合酶是促成幾丁質分子延長的酶，而CHS1的主要作用則是在細胞分裂中合成幾丁質。該基因在植物病原檢測中還未見報道，但曾在動物皮膚病病原分子檢測中有作為靶基因的報道，如李曉紅等[30]基于申克孢子絲菌的CHS1基因建立了孢子絲菌病PCR分子檢測方法。

N.parvum導致的核桃枝枯病在韓國以及我國山西和四川有發生[1113]。本試驗雖選擇了5個不同來源的N.parvum菌株進行了巢式PCR分子檢測技術的研究，但由于病原菌種群內遺傳多樣性較豐富，所以該技術是否能夠成功檢測其他更多來源的病原菌還有待下一步驗證。

參考文獻

[1] 鄧金龍.我國核桃生產現狀及發展策略[J].林產工業，2016（10）：5658.

[2] 雷瓊，康克功，林偉鋒.商洛地區核桃主要病害發生特點及防治策略[J].價值工程，2012（1）：281282.

[3] 李會欽，劉會峰，楊利娟.河南偃師核桃枝枯病的防治技術[J].果樹實用技術與信息，2012（10）：2728.

[4] 張改香.豫西地區核桃病害發生及相關因子分析[J].山西果樹，2011（6）：67.

[5] 張承胤，唐欣甫，張文忠，等.北京地區核桃主要病害的發生規律與防治措施[J].山西果樹，2012（2）：2526.

[6] 徐彧，馬朝陽，陳建華，等.成縣核桃主要病蟲害及其防治措施[J].經濟林研究，2007（4）：7073.

[7] 孫俊.遼寧新病害核桃枝枯病病原鑒定[J].果樹學報，2013（4）：669671.

[8] 張榆英，伍建榕，熊智，等.瀘水縣核桃衰退原因分析[J].中國森林病蟲，2013（3）：2830.

[9] LATORRE B A， TORRES R， ELFAR K. Wound protectants to prevent the stem canker （Neofusicoccum parvum） of blueberry [C]∥Abstracts of ICPP 2013 10th International Congress of Plant Pathology，2013.

[10]CHEON W， KIM Y S， LEE S G， et al. Branch dieback caused by Neofusicoccum parvum on walnut in Korea [C]∥Abstracts of ICPP 2013 10th International Congress of Plant Pathology， 2013.

[11]CHEON W. First report of branch dieback of walnut caused by Neofusicoccum parvum in Korea [J].Plant Disease，2013，97（8）： 1114.

[12]尹萬瑞，朱天輝.核桃枝枯病病原菌生物學特性及藥劑防治[J].東北林業大學學報，2016（7）：98101.

[13]YU Zhongdong， TANG Guanghui， PENG Shaobin， et al. Neofusicoccum parvum causing canker of seedlings of Juglans regia in China [J]. 林業研究（英文版）， 2015， 26（4）：10191024.

[14]金曉明.核桃樹主要病害發生規律及防治方法[J].果農之友，2016（3）：2627.

[15]李本金，劉裴清，劉小麗，等.荔枝霜疫霉巢式PCR和LAMP檢測方法的建立[J].農業生物技術學報，2016（6）：919927.

[16]楊萬風，劉艷，劉翔，等.進口大豆中菜豆暈疫病菌巢式PCR檢測方法的建立[J].中國油料作物學報，2015（1）：113118.

[17]沈萬寬，楊湛端，劉睿，等.基于PCR和巢式PCR技術的甘蔗黑穗病早期檢測[J].熱帶作物學報，2013（9）：17561760.

[18]張凡，侯敏，余傳信，等.巢式PCR法在日本血吸蟲易感水域哨鼠監測中的應用[J].中國病原生物學雜志，2015（4）：325328.

[19]劉彬，張祥林，王翀，等.向日葵白銹病菌巢式PCR檢測方法的研究[J].新疆農業科學，2011（5）：859863.

[20]何月秋.真菌菌絲體培養和提取DNA方法的改進[J].菌物系統，2000，19（3）：434.

[21]劉少華，陸金萍，朱瑞良，等.一種快速簡便的植物病原真菌基因組DNA提取方法[J].植物病理學報，2005，35（4）：362365.

[22]劉秀嶶，王峰，劉雪峰.落葉松枯梢病分子檢測初步研究[J].植物檢疫，2009（2）：14.