香蕉枯萎病菌致病力分化與ISSR遺傳多樣性分析

黃穗萍 郭堂勛 李其利

摘要 香蕉枯萎病是一種破壞香蕉維管束的全株性土傳病害。本研究旨在探討香蕉枯萎病菌致病力分化和遺傳多樣性。以30株采自我國廣西的香蕉枯萎病菌，16株分別來自澳大利亞和我國廣東、海南、福建、云南等地的香蕉枯萎病菌為對象，采用傷根灌淋法測定香蕉枯萎病菌的致病力，然后用篩選到的ISSR引物對46個香蕉枯萎病菌菌株和4個對照菌株（3個非致病性尖孢鐮刀菌和1個茄腐鐮刀菌）進(jìn)行ISSR遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，分離到廣西香蕉枯萎病菌1號生理小種（FOC1）8株，致病力強(qiáng)、中、弱類型比例分別為62.5%、12.5%和25%；廣西香蕉枯萎病菌4號生理小種（FOC4）22株，致病力強(qiáng)、中、弱類型比例分別為18.18%、63.64%和18.18%。14條ISSR引物擴(kuò)增出237個條帶，多態(tài)性條帶161個，多態(tài)性比例為67.93%，遺傳相似系數(shù)0.76～0.96。聚類分析顯示，以遺傳距離0.80為閾值時菌株被分為8個類群，所占比例分別為4%、10%、60%、16%、4%、2%、2%、2%。第三類群全部為香蕉枯萎病菌4號生理小種。第一、二、四和五類群總量的70.59%為香蕉枯萎病菌1號生理小種。第八類群為香蕉枯萎病菌3號生理小種。結(jié)果表明，在香蕉枯萎病菌與寄主協(xié)同進(jìn)化中，廣西的FOC1和FOC4出現(xiàn)明顯致病力分化。1號生理小種的遺傳多樣性比4號生理小種豐富。廣西香蕉枯萎病菌4號生理小種與海南、廣東的FOC4遺傳相似性較高。香蕉枯萎病菌生理小種類型與遺傳多樣性相關(guān)。致病力變異與遺傳多樣性無相關(guān)性。研究結(jié)果對香蕉枯萎病菌種群擴(kuò)張機(jī)制探討、遺傳動態(tài)分析以及有效防控措施的制定具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 香蕉枯萎病； 致病力； 遺傳多樣性

中圖分類號： S 436.681

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018007

Abstract Banana wilt is a whole-plant soil-borne disease that destroys banana vascular bundles. This study aimed to evaluate the pathogenicity differentiation and genetic diversity ofFusarium oxysporum f.sp.cubense （FOC）. Thirty FOC strains were collected from Guangxi and 16 FOC strains from Australia and Guangdong， Hainan， Fujian， Yunnan of China， and their pathogenicity was tested by root damage irrigation pipe method. The genetic similarity between the 46 FOC strains and four reference strains （three non-pathogenicF. oxysporum and oneF. solani） was studied by ISSR genetic diversity analysis using most suitable primers and annealing temperature. The results showed that eightF. oxysporum f.sp.cubense race 1 （FOC1） strains and 22F. oxysporumf.sp.cubenserace 4 （FOC4） strains were obtained from Guangxi. The proportions of strong， medium and weak pathogenic types of FOC1 were 62.5%， 12.5% and 25%， respectively， while the proportions of strong， medium， and weak pathogenic types of FOC4 were 18.18%， 63.64% and 18.18%， respectively. Fourteen ISSR primers produced totally 237 bands and 161 polymorphic bands， with a polymorphic proportion of 67.93%. The genetic similarity coefficient ranged from 0.76 to 0.96. Cluster analysis showed that， when the genetic distance was 0.80， the strains could be divided into eight groups， with a proportion of 4%， 10%， 60%， 10%， 4%， 2%， 2% and 2%， respectively. Among them， all strains of the third group were FOC4， while 70.59% of strains in the total of 1st， 2nd， 4th and 5th groups were FOC1. The 8th group belonged to FOC3. The results indicated that FOC1 and FOC4 of Guangxi had apparent pathogenicity differentiation with coevolution with the host. At the same time， the genetic diversity of FOC1 was richer than that of FOC4. Higher genetic similarities existed between FOC4 of Guangxi and FOC4 of Hainan， Guangdong. It suggested that the types of FOC species were associated with the genetic diversity， but there was no correlation between pathogenicity variation and genetic diversity. These results may help us understand the population expansion mechanism， analyze genetic dynamics and formulate effective management measures againstF. oxysporum f.sp.cubense.

Key words Fusarium oxysporum f.sp.cubense； pathogenicity； genetic diversity

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusarium oxysporum f.sp. cubense侵染引起的破壞香蕉維管束的全株性土傳病害，其病原菌適生性強(qiáng)、分布廣、危害重、傳播途徑復(fù)雜、防治難度大，是香蕉生產(chǎn)的主要障礙。

根據(jù)對寄主的致病性差異，香蕉枯萎病菌分成4個生理小種，即香蕉枯萎病菌1號（FOC1）、2號（FOC2）、3號（FOC3）和4號小種（FOC4），香蕉枯萎病菌4號生理小種又分為熱帶4號生理小種（TR4）和亞熱帶4號生理小種（STR4）。中國的香蕉枯萎病菌屬于1號和熱帶4號小種。目前中國的FOC1和FOC TR 4已出現(xiàn)明顯致病力分化[1-4]，而且小種內(nèi)遺傳變異非常豐富。

目前研究香蕉枯萎病菌的遺傳多樣性方法主要有RAPD[3，5-6]、AFLP[7-8]、ISSR等。ISSR （inter simple sequence repeat）是1994年由Zietkiewicz等[9]提出的一種建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，與其他分子標(biāo)記相比，該標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性水平高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。Thangavelu等[10]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)研究了印度98株香蕉枯萎病菌1號和2號生理小種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)印度香蕉枯萎病菌遺傳多樣性非常豐富，且FOC具有多源進(jìn)化特性；ISSR技術(shù)能很好地區(qū)分FOC的生理小種類型。張賀等[11]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對我國香蕉產(chǎn)區(qū)的香蕉枯萎病菌也進(jìn)行了ISSR分析，認(rèn)為ISSR聚類組群的劃分與病原菌的寄主和小種有很明顯的相關(guān)性。但是Thangavelu等[10]和張賀等[11]僅是探討了生理小種類型和寄主與香蕉枯萎病菌遺傳多樣性的關(guān)系，沒有研究香蕉枯萎病菌致病力與遺傳多樣性的關(guān)系。

為了探討香蕉枯萎病菌致病力分化和遺傳多樣性，本研究于2012-2013年間，從廣西香蕉產(chǎn)區(qū)采集香蕉枯萎病菌30株，同時收集16株澳大利亞及我國廣東、海南、福建和云南等地的香蕉枯萎病菌，測定其致病力，得到具有不同地理來源和致病力的香蕉枯萎病菌株。然后采用ISSR技術(shù)研究其遺傳多樣性，分析致病力、地理來源與遺傳多樣性的關(guān)系，為研究該病害流行和防治技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試香蕉枯萎病菌菌株及對照菌株見表1。菌株編號1～31、44、46和47菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。菌株32、33為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所謝藝賢研究員饋贈，菌株34～38、40～43和48為東莞蔬菜香蕉研究所呂順高級農(nóng)藝師饋贈，菌株45、49、50為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院姜子德教授饋贈，菌株39為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林時遲研究員惠贈。

1.1.2 供試寄主

6～7 葉期粉蕉Musa ABB Group 和巴西蕉Musa AAA Group 組培苗均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院香蕉組培中心提供。

1.2 病原菌致病力測定

香蕉枯萎病菌1號生理小種接種粉蕉Musa ABB group，香蕉枯萎病菌4號生理小種接種巴西蕉Musa AAA group，接種后置于溫室大棚培養(yǎng)，40 d后調(diào)查香蕉枯萎病的發(fā)病情況。計算病情指數(shù)和劃分菌株的致病力類型。1號生理小種菌株的致病能力以所侵染的粉蕉的病害嚴(yán)重度表示，4號生理小種菌株的致病能力以所侵染的巴西蕉的病害嚴(yán)重度表示。

1.2.1 菌液制備與接種方法

將4℃下保存的各供試菌株置于 PDA 平板培養(yǎng)基上，25℃活化培養(yǎng)5 d。挑取新鮮菌絲接種到PDB液體培養(yǎng)液中，25℃振蕩（160 r/min）培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)好的菌液用4層紗布過濾菌絲，制成孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計算孢子懸浮液濃度并用滅菌蒸餾水將孢子懸浮液濃度調(diào)整到1×106 cfu/mL，備用。

采用傷根灌淋法測定香蕉枯萎病菌的致病力。將香蕉組培苗自營養(yǎng)杯中拔出后（傷根）重新種到營養(yǎng)杯中。沿著香蕉苗的莖淋50 mL配制好的香蕉枯萎病菌孢子懸浮液。每個處理15株香蕉苗。以清水為對照。

1.2.2 病情調(diào)查記載及分級標(biāo)準(zhǔn)

參照Saravanan等[12]的病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)，對接種不同菌株的香蕉組培苗的球莖癥狀進(jìn)行病級統(tǒng)計，計算病情指數(shù)。1級：維管束完全干凈，沒有變色；2級：維管束出現(xiàn)點(diǎn)狀變色，變色面積不足1/3維管束組織；3級：1/3～2/3的維管束組織變色；4級：超過2/3的維管束組織變色，但仍有部分面積沒變色；5級：整個維管束組織變色。

病情指數(shù)計算公式：

病情指數(shù)（DI）=〔（∑各級病株數(shù)×相應(yīng)病級）/（總株數(shù)×最高病級）〕×100。

根據(jù)病情指數(shù)對香蕉枯萎病病原菌進(jìn)行致病力分級。強(qiáng)致病力（S）：DI≥60.00；中致病力（M）：30≤DI<60.00；弱致病力（W）：30.00≤DI。

1.3 ISSR分析

1.3.1 供試菌株基因組DNA的提取

菌株培養(yǎng)：將供試菌株接種于PDA平板，25℃培養(yǎng)10 d。

DNA提取：用天根DNA提取試劑盒（DP305）提取菌株DNA，具體操作參照天根DNA提取試劑盒說明書。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA完整性后，再用超微量紫外可見分光光度計（Thermo Nanodrop ND2000C）檢測其純度與濃度，并將其稀釋至10 ng/μL，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ISSR引物及退火溫度篩選

從文獻(xiàn)中[10，13-21]選取26對ISSR引物進(jìn)行初篩選。在供試菌株中選取10個具有代表性的菌株，混合其DNA作為ISSR引物初篩選的模板DNA。每個ISSR引物設(shè)置3個退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：1× PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.5～2.5 mmol/L MgCl2，0.5 μmol/L引物， 1 Unit ofTaq DNA聚合酶，25 ng基因組DNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃變性30 s，44～64℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，40個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳，70 V，4 h。篩選擴(kuò)增條帶較多、信號強(qiáng)、背景清晰的引物及其合適的退火溫度，用于全部 DNA 樣品的擴(kuò)增。

1.3.3 ISSR-PCR擴(kuò)增及電泳檢測

以篩選好的14對引物和退火溫度（表3）對全部供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序按照1.3.2所述。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳，70 V，4 h。電泳完畢用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照并記錄條帶。

1.3.4 統(tǒng)計分析

采用 NTSYS-pc 2.0 生物軟件，用UPGMAM 法對50個菌株的 ISSR引物擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，建立樹狀聚類關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西香蕉枯萎病菌菌株致病力分化與地理來源的關(guān)系

由表1所示，供試的廣西8株香蕉枯萎病菌1號生理小種（FOC1）侵染香蕉后，香蕉植株的病情指數(shù)為5～78.33，平均病指53.96，強(qiáng)、中、弱病株數(shù)分別為5、1、2，占FOC1菌株數(shù)的62.5%、12.5%和25%。供試的22株香蕉枯萎病菌4號生理小種（FOC4）侵染所致的植株病情指數(shù)為11.67～75.00，平均病指42.03，強(qiáng)、中、弱病株數(shù)分別為4、14、4，占FOC4菌株數(shù)18.18%、63.64%和18.18%。由此可見，廣西的FOC1和FOC4均出現(xiàn)明顯致病力分化。

從表2可知，F(xiàn)OC1分布于欽州市、玉林市博白縣、南寧市、崇左市龍州縣；FOC4分布于北海市、欽州市、南寧市及武鳴縣、隆安縣、百色市平果縣。其中欽州市出現(xiàn)了FOC1強(qiáng)、中致病力菌株和FOC4強(qiáng)、中、弱致病力菌株。龍州縣出現(xiàn)了FOC1強(qiáng)、弱致病力菌株。武鳴縣出現(xiàn)了FOC4強(qiáng)、中、弱致病力菌株。由此可見，菌株致病力強(qiáng)弱與地理來源無顯著相關(guān)性。

2.2 ISSR引物的擴(kuò)增

26對ISSR引物中有14對引物的擴(kuò)增背景清晰，信號強(qiáng)，條帶數(shù)多，其多態(tài)性比例范圍為42.86%～100%（表3）。14對引物的序列和合適的退火溫度見表3，用于進(jìn)一步擴(kuò)增全部菌株的DNA。

14對ISSR引物擴(kuò)增全部菌株DNA的總條帶數(shù)為237個，多態(tài)性條帶數(shù)161個，條帶大小200～5 000 bp，平均多態(tài)性比例為67.93%。其中引物2和引物14的多態(tài)性比例為94.12%和100%，分別見圖1和圖2。由此可見，ISSR指紋具有豐富的多態(tài)性，可用于分析FOC的遺傳多樣性。

2.3 香蕉枯萎病菌ISSR指紋遺傳多樣性與生理小種的關(guān)系

聚類分析顯示（圖3），在閾值為0.80時菌株被分為8個類群，所占比例分別為4%、10%、60%、16%、4%、2%、2%、2%。FOC4分布于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ類群中，其中第Ⅲ類群全部為香蕉枯萎病菌4號生理小種，占供試FOC4總量的91%。在第Ⅲ類群中，廣西FOC4與海南和廣東的FOC4遺傳距離比云南和福建的短。FOC1分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ類群中，占供試FOC1比例分別為16.7%、25%、41.7%、16.6%。FOC3分布于第Ⅷ類群中。由此可見，香蕉枯萎病菌的遺傳多樣性豐富，F(xiàn)OC4主要集中在第Ⅲ類群，F(xiàn)OC1分布較為分散，F(xiàn)OC1的遺傳變異比FOC4大。廣西FOC4與海南、廣東的FOC4遺傳相似性高。ISSR指紋分析與生理小種類型存在相關(guān)性。

2.4 香蕉枯萎病菌ISSR指紋遺傳多樣性與致病力分化的關(guān)系

供試的46個香蕉枯萎病菌中，F(xiàn)OC1有12株，F(xiàn)OC4有33株。FOC1強(qiáng)致病力菌株共7株，分布于Ⅰ類群2株、Ⅱ類群3株、Ⅳ類群2株；中致病力菌株共2株，分布于Ⅳ類群中；弱致病力菌株共3株，分布于Ⅳ類群1株、Ⅴ類群2株。Ⅰ類群和Ⅱ類群的FOC1全部是強(qiáng)致病力菌株；Ⅳ類群中的FOC1有強(qiáng)、中和弱致病力菌株，數(shù)量分別是2∶2∶1；Ⅴ類群中的FOC1全部是弱致病力菌株。FOC4強(qiáng)致病力菌株共9株，全部在Ⅲ類群中；中等致病力菌株共16株，分布于Ⅱ類群和Ⅲ類群中，其中Ⅲ類群共15株，占中等致病力菌株總數(shù)的93.75%；弱致病力菌株共8株，分布于Ⅲ類群、Ⅳ類群和Ⅵ中，比例分別是75%、12.5%、12.5%（表4）。由此可見，香蕉枯萎病菌ISSR指紋遺傳多樣性與致病力分化無明顯相關(guān)性。

3 討論

香蕉枯萎病病原菌的變異是由寄主和環(huán)境因子與病原菌之間的協(xié)同進(jìn)化所導(dǎo)致[5]。植物病原菌在不同的環(huán)境、營養(yǎng)條件下，寄主植物外界生態(tài)因素作用以及病原菌本身的遺傳變異使病原菌的致病力不斷發(fā)生變化。寄主與病原菌在長期演變的過程中，逐步形成了一些較為穩(wěn)定的類型[1]。香蕉枯萎病病原菌的群體存在著豐富的遺傳多樣性[22-23]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OC致病力強(qiáng)弱與地理來源沒有相關(guān)性。香蕉枯萎病菌的進(jìn)化具有多源特性，與 Groenewald 等[7]的研究結(jié)果一致。遺傳多樣性分析表明，1號生理小種的遺傳變異較4號生理小種豐富。早在1960年，廣西就出現(xiàn)了香蕉枯萎病菌1號生理小種。直到2012年，廣西才首次報道了香蕉枯萎病菌4號生理小種的危害。可見，F(xiàn)OC1在廣西出現(xiàn)的時間較FOC4早。在與寄主的長期協(xié)同進(jìn)化中，廣西FOC1整體群體致病力比較強(qiáng)，以強(qiáng)致病力菌株為優(yōu)勢菌株。而廣西FOC4以中等致病力菌株為優(yōu)勢菌株。廣西FOC1的遺傳多樣性較廣西FOC4豐富。

本研究發(fā)現(xiàn)廣西FOC4與海南、廣東的FOC4遺傳相似性高，親緣關(guān)系較近，推測廣西的FOC4由海南和廣東的FOC4衍生而來。2011-2012年，海南的香蕉枯萎病處于暴發(fā)階段，很多蕉地不能再種植香蕉。那時，廣西的香蕉枯萎病還處于零星發(fā)生階段[24]。海南很多蕉農(nóng)轉(zhuǎn)移到廣西種植香蕉。由于交往的頻繁，海南病原菌很可能通過組培苗和農(nóng)具等途徑傳播到廣西。2008年，廣西出現(xiàn)了罕見的凍害，香蕉損害嚴(yán)重。補(bǔ)種香蕉需要大量的組培苗，部分蕉農(nóng)從廣東疫區(qū)調(diào)運(yùn)了組培苗到廣西欽州等地種植。香蕉枯萎病菌也隨著帶病的組培苗進(jìn)入了廣西。

張賀等[11]只研究了香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種的遺傳多樣性，而本研究分析了香蕉枯萎病1號、3號和4號生理小種的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISSR指紋分析與1號、3號和4號生理小種存在明顯相關(guān)性。Thangavelu 等[10]的研究也表明ISSR指紋分析能區(qū)分1號和2號生理小種。可見，選取具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)菌株，將田間采集的香蕉枯萎病菌菌株與之進(jìn)行ISSR遺傳指紋分析，通過構(gòu)建聚類樹，分析采集到的香蕉枯萎病菌的生理小種類型，以監(jiān)測香蕉枯萎病菌生理小種變異情況，具有可行性。

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（責(zé)任編輯：田 喆）