微小昆蟲透射電鏡樣品制備方法的改良

郭付振 高繼華 張國云

摘要

為進一步提高微小昆蟲不同器官（觸角感器、口器感器、復眼及顏色較淡的部位如：腸道、腺體、唾液道、精子、卵母細胞等）透射電鏡樣品制備效率，對微小昆蟲不同器官的透射電鏡樣品制樣方法進行了改良。建立了簡易的“紙巾包裹法”和“瓊脂包埋法”。這兩種方法具有簡單快速、操作方便、易于掌握的優點，并解決了大量樣品在漂洗過程中易被吸管吸走、或黏附在吸管壁上被帶走等“損耗”的問題，與常規制樣方法相比，既節約了大量操作時間，也保證了樣品的數量和質量，提高了微小昆蟲生物樣品制樣的效率。

關鍵詞

微小昆蟲； 樣品制備； 改良； 透射電子顯微鏡

中圖分類號：

Q 96.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017314

Improvement of the tiny insect sample preparation method for

transmission electron microscope

GUO Fuzhen1， GAO Jihua2， ZHANG Guoyun3

（1.Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management，Ministry of Education，College ofPlant Protection， Northwest A & F University， Yangling 712100， China； 2. Xinzheng Municipal Agricultural andRural Committee， Henan Province， Xinzheng 451100， China； 3. State Key Laboratory of Crop StressBiology in Arid Areas， Northwest A & F University， Yangling 712100， China）

Abstract

This study was aimed to improve the sample preparation efficiency for different organs （antenna sensilla， mouthpart sensilla， compound eyes and lightcolored parts such as intestine， gland， saliva， sperm， oocytes， etc.） of tiny insects for transmission electron microscopy. The simple “paper towel wrapping method” and “agar embedding method” were established，which has the advantages of simplicity and rapidness， are easy to operate and master， and helps solve the problems of losing a large number of samples during rinsing as the samples were prone to being sucked by the drip pipe or attached to the drip pipe wall or taken away. Compared with the conventional sample preparation method， it not only saves a lot of operation time， but also ensures the quantity and quality of the sample. The simple new method improves the efficiency of sample preparation for the biological samples of tiny insects.

Key words

tiny insect； sample preparation； improvement； transmission electron microscope

電子顯微鏡廣泛應用于材料科學、生命科學和臨床病理診斷等領域，是現代科學研究領域不可缺少的手段之一，在生命科學研究領域的重要性和不可替代的地位更加顯著。電子顯微鏡是研究生物組織、細胞及細胞器超微結構的常用工具，也是科研工作者探索生物真實活動的手段之一。但由于生物電鏡樣品制備過程繁瑣，有時也難以獲得高質量的樣品，影響了對樣品結構的觀察研究，耗費了研究者大量的時間、精力和財力，在一定程度上阻滯了科研的發展[18]。特別是昆蟲身體表面被覆高度骨化的外骨骼、角膜和角質層，質地堅硬，固定液和包埋劑均難以滲透，對于用透射電鏡研究其內部超微結構，精確并清晰地觀察身體內部組織細胞超微結構的變化是個巨大的挑戰。首先，要確保電鏡固定液快速有效地進入微小的昆蟲體內，保護好其體內結構，防止細胞結構溶解；其次，要確保樣品在脫水后包埋劑能很好地滲入組織結構中，起到均勻地包埋支持作用；最后，樣品在處理完后包埋時，對于特定部位尤其是觸角、口器感器、復眼和肌肉等部位的取向定位也是需要解決的一個重要問題[925]。常規透射電鏡生物樣品制備技術是進行生物樣品超微結構研究中最基本，也是最重要的步驟，它的高效、高質量，對獲得高清晰、高質量的圖片有著至關重要的影響；而且該步驟的不斷改進對電鏡技術的提高和應用起著重要的推動作用。

常規制備微小昆蟲不同部位器官（觸角感器、口器感器、復眼及顏色較淡的部位如：腸道、腺體、唾液道、精子、卵母細胞等）的透射電鏡樣品時總是耗時、費力，多次漂洗過程中樣品被吸管吸走、或黏附在吸管壁上被帶走或者附著在離心管壁等“損耗”，影響了透射電鏡樣品制備效率。作者經過摸索，發現利用“紙巾包裹法”和“瓊脂包埋法”不僅可以提高透射電鏡樣品制備效率，而且具有操作方便、簡單快速、易于掌握的優點。

1 材料與方法

1.1 樣品

玉米黃呆薊馬Anaphothrips obscurus（Müller） 成蟲（實驗室飼養10～15代）由西北農林科技大學植物保護學院纓翅目分類實驗室提供。成蟲用盆栽的小麥或玉米幼苗在人工氣候箱（25℃±1℃，L∥D=14 h∥10 h，RH：75%±5%）中飼養。榕母管薊馬Gynaikothrips ficorum （Marchal）成蟲采自廣東省廣州市榕樹葉上。

1.2 試劑與儀器

無菌水、0.2 mol/L磷酸緩沖液、2.5%戊二醛溶液、2%鋨酸（OsO4）、乙醇溶液（10%，30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%）、倫敦白膠、0.3 mL膠囊、2%醋酸雙氧鈾、4%檸檬酸鉛、紙巾、瓊脂、超凈工作臺、Nikon SMZ1500顯微鏡、Eppendorf Mix Mate渦旋振蕩器、Eppendorf移液器、培養箱、培養皿、PCR管（1.5 mL和4 mL）、冷凍干燥儀VFD21S、離子濺射儀MSP1S、Leica EM UC7、掃描電鏡Hitachi S3400N、透射電子顯微鏡JEOL JEM1230等。

1.3 試驗方法

1.3.1 復眼和口器樣品的制備方法

取玉米黃呆薊馬和榕母管薊馬雌成蟲各10頭直接放到預冷的2.5%戊二醛溶液中，在Nikon SMZ1500光學顯微鏡下迅速將帶有完整復眼或口器的頭部切下，立即放于培養皿內用預冷的2.5%戊二醛溶液浸濕的2 cm×2 cm正方形紙巾（由3層，21 cm×21 cm的泉林本色秸稈手帕紙剪成，柔韌度好）上（圖1），等全部取完樣品，如圖所示沿ef向對角線bd處用電鏡專用極細的尖頭鑷子向里折，將樣品完全蓋住（圖1A），接著沿gh向對角線bd處再向里折（圖1B），將兩側的邊也折起來（圖1C，D），再接著沿對角線bd依次向c處折（圖1E，F），最后將折疊好的樣品迅速放入裝有預冷的2.5%戊二醛溶液的4 mL圓底離心管里，抽真空約30 min，蓋好蓋子，放到4℃ 下避光固定6 h。固定后的樣品用0.1 mol/L，pH 7.2磷酸緩沖液漂洗6次，再用鋨酸（OsO4）固定液（0.1 mol/L，pH 7.2）固定2 h，再用磷酸緩沖液漂洗6次后，經不同梯度的乙醇溶液（10%，30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%，100%）脫水，然后樣品依次經過不同體積比的乙醇—倫敦白膠混合物（V乙醇：VLRWhite=3∶1，1∶1，1∶3）與兩次純倫敦白膠滲透。包埋時小心用細頭鑷子將紙巾慢慢打開，最后露出樣品，逐一將樣品放到膠囊內，蓋好蓋子，并壓緊蓋子，將包埋好的樣品放入烘箱中60℃聚合48 h。聚合后的樣品塊在Leica EM UC7切片機上用鉆石刀切成厚度約50～70 nm 的超薄切片，依次用2%醋酸雙氧鈾染色10 min和4%檸檬酸鉛染色8 min，最后在JEOL JEM1230透射電子顯微鏡（加速電壓80 kV）下觀察和拍照。

1.3.2 觸角樣品的制備方法

取玉米黃呆薊馬和榕母管薊馬雌蟲各10頭直接放進預冷的25%戊二醛溶液中，在Nikon SMZ1500光學顯微鏡下迅速將帶有完整觸角的頭部切下，把觸角的柄節、梗節、鞭節（ⅠⅥ）分別迅速切下，并立即放入裝有幾滴預冷的2.5%戊二醛溶液的1.5 mL的尖底離心管中，加入2～3滴40℃左右1.5%的瓊脂，4℃下避光冷凝20 min，用牙簽貼著離心管壁把瓊脂包裹著樣品的凝膠塊刮下來，迅速放入裝有3.8 mL預冷的2.5%戊二醛溶液的4 mL圓底離心管中，觸角每節至少取6～7個瓊脂包埋塊，4℃下避光固定6 h。固定后的樣品經磷酸緩沖液漂洗6次，用鋨酸（OsO4）固定液（0.1 mol/L，pH 7.2）固定2 h，再用磷酸緩沖液漂洗6次后，依次經不同濃度梯度的乙醇溶液（10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水。樣品依次再經過不同體積比的乙醇—倫敦白膠混合物（V乙醇：VLRWhite=3∶1，1∶1，1∶3）與兩次純倫敦白膠滲透。包埋時小心用牙簽將瓊脂包埋塊逐一放到膠囊內，蓋好蓋子，并壓緊蓋子，將包埋后的樣品放入烘箱中60℃聚合48 h。聚合后的樣品塊在Leica EMUC7切片機上用鉆石刀切成厚度約50～70 nm的超薄切片，依次用2%醋酸雙氧鈾染色10 min和4%檸檬酸鉛染色8 min，最后在JEOL JEM1230透射電子顯微鏡（加速電壓80 kV）下觀察和拍照。

2 結果與分析

2.1 口器感器和復眼觀察

“紙巾包裹法”處理后的樣品——玉米黃呆薊馬口器下顎須的縱切面（圖2a）、橫切面（圖2b）和榕母管薊馬復眼橫切面（圖2d）和縱切面（圖2e）及傳統方法處理的樣品——玉米黃呆薊馬口器側唇舌的橫切面（圖2c）和榕母管薊馬復眼橫切面（圖2f），所獲得圖片都顯示：細胞結構完整，口器感器的結構保存完好，下顎須的6個神經樹突鞘清晰可見（圖2b），視覺感器的4個晶錐（cc）清楚，感桿（rh）的微絨毛大多與細胞長軸垂直，信息豐富。但兩種處理方法的圖片在邊緣局部區域會出現滲透不理想的現象，這是由于昆蟲體表骨骼化程度高或有堅韌的角質化層，固定液和樹脂難以滲透的原因造成的。

2.2 觸角感器觀察

從圖2可見，“瓊脂包埋法”處理后的樣品——榕母管薊馬觸角的縱切面（圖2g～h）和傳統方法處理的樣品——榕母管薊馬觸角的縱切面（圖2i），都能獲得較好的圖片，亞細胞結構完好，神經樹突結構清晰（圖2g，h）。

3 討論

結果表明，改良方法和傳統方法處理樣品都能獲得理想的效果。改良方法不僅具有操作方便、簡單快速、易于掌握的優點，而且還克服了大量樣品在多次漂洗過程中“損耗”的缺點，特別是對于珍貴的樣品不但保證了樣品的數量，也獲得了高質量的電鏡圖片。

獲得高質量、高清晰電鏡圖片的關鍵因素是樣品的固定效果良好及超薄切片的質量。一般植物材料用4%戊二醛溶液固定6 h或鋨酸固定2 h；動物組織用2.5%戊二醛溶液固定4 h或鋨酸固定1 h，固定的時間也不宜過長，一般不超過4 h，過長會造成組織變脆，為切片帶來困難[2627]。無水乙醇與LRWhite倫敦白膠梯度滲透，能使滲透效果均勻，有利于制成高質量包埋塊，提高樹脂的可切性。適當延長時間，能提高樣品的滲透效果。在包埋塊制作過程中，注意膠囊蓋子一定要密封好，蓋子壓實，否則會由于倫敦白膠與空氣接觸而使樣品變軟，切片后會出現刻痕和發散現象，影響超微結構的觀察。

“紙巾包裹法”在每次漂洗時需注意吸管或槍頭的尖端不要扎破紙巾，否則樣品會從破洞中出來，在每一步的清洗過程中仍會“損耗”。

“瓊脂包埋法”可以準確定位，例如昆蟲觸角的柄節、梗節、鞭節各節上的感覺器各不相同，在超薄切片機上要想切到想要的部位，非常困難，利用“瓊脂包埋法”可以準確地分節，修塊時易于定位，準確地切到需要的部位。但需注意包埋樣品的瓊脂不能太厚，如果過厚，可以用新的雙面刀片粗修，使樣品最多1 mm2大小，否則固定效果也會減弱。

參考文獻

[1] 楊勇驥，湯瑩，葉煦亭，等.醫學生物電子顯微鏡技術[M].上海：第二軍醫大學出版社，2012：77.

[2] 張燕如，任利利，駱有慶.透射電鏡樹脂包埋塊中昆蟲感器的定位技術[J].應用昆蟲學報，2013，50（5）：14791483.

[3] 謝家儀，董光軍，劉振英.掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J].電子顯微學報，2005，24（4）：440440.

[4] 李向黨.游離細胞超快掃描電鏡樣品制備法[J].電子顯微學報，2001，20（4）：537538.

[5] 曲淑賢，高船舟，呂廣艷，等.懸浮細胞掃描電鏡快速制樣方法[J].醫學信息，2008，21（7）：11621163.

[6] 路菊，陶忠芬，可金星.懸浮狀物質的樣品制備及掃描電鏡觀察[J].第三軍醫大學學報，2007，29（4）：368369.

[7] 李培京.掃描電鏡生物樣品制備與觀察[J].現代科學儀器，2008（3）：124125.

[8] 梁靜南，劉一葦.對掃描電鏡觀察微生物樣品出現磷酸鹽結晶現象的改良[J].電子顯微學報，2012，31（2）：194195.

[9] KLOWDEN M J.Physiological systems in insect [M]. Second Edition.Elsevier： Academic Press， 2007： 552553.

[10]許再福.普通昆蟲學[M].北京： 科學出版社，2009： 7577.

[11]HEMING B S. Structure and function of the mouthparts in larvae of Haplothrips verbasci （Osborn） （Thysanoptera， Tubulifera， Phlaeothripidae）[J]. Journal of Morphology，1978， 156： 138.

[12]HUNTER W B， ULLMAN D E. Analysis of mouthparts movements during feeding of Frankliniella occidentalis （Pergande） and F. schultzei Trybom （Thysanoptera： Thripidae）[J]. International Journal of Insect Morphology & Embryology， 1989， 18： 161171.

[13]CHISHOLM I F， LEWIST. A new look at thrips （Thysanoptera） mouthparts， their action and effects of feeding on plant tissue [J]. Bulletin of Entomological Research， 1984， 74： 663675.

[14]ULLMAN D E， MCLEAN D L. Anterior alimentary canal of the pear psylla， Psylla pyricola Foerster （Homoptera： Psyllidae）[J]. Journal of Morphology，1986， 189：8998.