抗芐嘧磺隆野慈姑乙酰乳酸合成酶的突變研究

付丹妮　趙鉑錘　孫中華　紀明山

摘要

近年來，野慈姑Sagittaria trifolia L.在中國東北稻區發生和危害日趨嚴重，部分稻區使用芐嘧磺隆已無法有效防除該雜草。為了明確野慈姑抗藥性發生的根本原因，本試驗從分子水平上對野慈姑抗芐嘧磺隆的機理進行了研究。通過對抗藥性（H4）和敏感性（S）野慈姑種群靶標酶乙酰乳酸合成酶（ALS）基因片段進行擴增和克隆，比較其DNA序列的差異，確定導致抗藥性產生的ALS氨基酸突變位點。結果表明，與敏感性野慈姑ALS基因相比，H4種群第197位脯氨酸（Pro）突變為蘇氨酸（Thr），該位點的突變可能是H4野慈姑種群對芐嘧磺隆產生抗藥性的主要原因。ALS第197位Pro突變為Thr致使對芐嘧磺隆產生抗藥性是第一次在野慈姑種群中報道。

關鍵詞

水稻田； 野慈姑； 靶標抗藥性

中圖分類號：

S 481.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017232

Mutation in acetolactate synthase of Sagittaria trifolia resistant tobensulfuronmethyl

FU Danni， ZHAO Bochui， SUN Zhonghua， JI Mingshan

（College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract

In recent years， Sagittaria trifolia L. has been a serious problem in paddy fields in northeast of China. It is very difficult to control by bensulfuronmethyl in some areas. The objective of this study is to understand the molecular mechanism of the resistance to bensulfuronmethyl in S.trifolia and to find the specific mutation sites in amino acid sequence of acetolactate synthase （ALS） in the resistant S.trifolia populations.Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from susceptible （S） and resistant （H4） S.trifolia populations to bensulfuronmethyl， respectively， and sequenced subsequently.Sequence analysis showed that H4 population had a mutation at position 197（Pro）. The mutation was Pro197Thr，which may be responsible for the resistance to bensulfuronmethyl in the S.trifolia population.Pro197Thr mutation conferring resistance to bensulfuronmethyl is reported for the first time in S.trifolia.

Key words

paddy field； Sagittaria trifolia； targetsite resistance （TSR）

野慈姑Sagittaria trifolia L.，澤瀉科慈姑屬多年生水生或沼生草本植物，主要分布于熱帶以及亞洲的溫帶地區[1]，是水稻田常見的闊葉雜草之一，以球莖進行營養繁殖為主。芐嘧磺隆（bensulfuronmethyl）屬磺酰脲類除草劑，通過抑制植物體內的乙酰乳酸合成酶ALS酶活性，阻止支鏈氨基酸的合成，從而導致植物蛋白質合成受損，最終殺死植物[23]。自20世紀80年代中后期，由于芐嘧磺隆具有活性高、選擇性強、毒性低等特點，在我國東北水稻產區開始廣泛使用，使野慈姑得到了有效防治。而由于芐嘧磺隆作用位點單一和大量連續使用，導致了抗芐嘧磺隆的野慈姑大量出現。2000年前后，芐嘧磺隆對野慈姑的防效明顯下降，野慈姑的發生和危害日趨嚴重[4]，相繼在吉林省[5]和遼寧省[6]發現了抗磺酰脲類除草劑的野慈姑種群。

在大多數情況下，雜草對ALS抑制劑產生抗藥性是由ALS基因一個或幾個位點突變所引起[7]。目前，在抗ALS抑制劑的雜草中，靶標酶上已發現有8個突變位點（Alal22，Prol97，Ala205，Asp376，Arg377，Trp574，Ser653，Gly654）發生28種氨基酸替換，其中任何一個位點發生突變，均可大幅度降低除草劑品種與雜草靶標的親和力[810]。Guttieri等[11]在1992年報道了毒萵苣Lactuca seriola和地膚Kochia scoparia對ALS抑制劑的抗性是由197位脯氨酸突變所引起，首次從分子水平上研究了雜草抗藥性機理。隨著研究技術的發展，更多雜草的ALS基因被克隆、測序、分析，抗藥性機理得到更好的解釋。

我國東北地區使用芐嘧磺隆防治水稻田雜草具有較早的歷史，根據田間調查和農民的反映，大多數稻田的野慈姑已經對芐嘧磺隆產生了抗藥性。研究野慈姑對芐嘧磺隆的抗藥性問題，對抗藥性野慈姑的治理以及指導農民正確使用除草劑具有重要意義。本研究從分子水平上確定野慈姑對芐嘧磺隆的抗藥性是由于ALS基因突變所引起，并初步明確其產生抗藥性突變的基因位點。為延緩野慈姑抗藥性種群的發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗藥性野慈姑球莖（H4）于2015年5月采自黑龍江省雙鴨山市寶清縣方盛村多年連續使用磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆的稻田，野慈姑已對芐嘧磺隆產生抗藥性。將采集的球莖種植于無孔的塑料花盆內（23 cm×15 cm），置于室外正常水分管理，待其長至2～3葉期用30%芐嘧磺隆可濕性粉劑（上海杜邦農化有限公司）120 g/hm2莖葉噴霧處理，處理后存活的植株繼續培養。

對照敏感性野慈姑幼苗（S）于2015年6月采自遼寧省沈陽市棋盤山風景區遠離稻田的湖邊（未使用過除草劑）。將采集的幼苗種植于無孔的塑料花盆內（23 cm×15 cm），置于室外正常水分管理。隨機挑選20株用30%芐嘧磺隆可濕性粉劑30 g/hm2莖葉噴霧處理，21 d后全部死亡，未處理植株繼續培養。2015年11月上旬從花盆中挖出抗藥性和敏感性球莖分別保存于4℃冰箱中，待用。

取冰箱中保存的大小一致的抗藥性（H4）和敏感性（S）野慈姑球莖分別放置于裝有清水的培養皿中，在28℃光照培養箱內催芽3 d后，每盆3個球莖，分別種植于無孔的塑料盆內（23 cm×15 cm）。種植深度3 cm，保持水層3～5 cm。試驗用土為未使用過除草劑的稻田土。放置于溫室中，生長條件為白天（25±5）℃，夜間（14±5）℃。待植株長至3～4葉期，取幼嫩葉片，放入-80℃冰箱中保存，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 野慈姑DNA的提取

用Tiangen生化科技（北京）有限公司的DNAsecure Plant Kit提取抗藥性（H4）和敏感性（S）野慈姑的DNA，各取10個葉片進行提取。用紫外分光光度計法檢測DNA的濃度和純度。用OD260/OD280衡量DNA純度，比值大于1.9，表明有RNA污染；小于1.6，表明有蛋白質、酚等污染。

1.2.2 野慈姑ALS基因片段的擴增和克隆

用表1所列兩對引物分別擴增H4和S野慈姑DNA，產物包含已報道的8個突變位點。25 μL的PCR反應體系中包括：葉片總DNA（60 ng/μL）1.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，2×Es TaqMasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應條件為：94℃預變性4 min，然后94℃變性30 s，在每個引物的最佳退火溫度下退火30 s（表1），72℃延伸90 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。

PCR反應結束后，取5 μL產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收純化，將回收片段與pUCT載體連接，然后轉到大腸桿菌感受態細胞DH5α中，均勻涂布于含有Xgal/IPTG的氨芐青霉素抗性的LB固體培養基上培養過夜，選擇白色菌落挑至含氨芐青霉素的液體培養基，振蕩培養過夜，用生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒。對重組質粒按上述PCR條件進行擴增，并進行電泳檢測，出現目的片段的為陽性克隆。

1.2.3 測序及序列分析

陽性克隆的序列測定采用美國ABI公司的3730XL測序儀和雙脫氧鏈終止法進行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。每個種群選取10株單個植株用做突變檢測，每個片段測序5個陽性克隆。將測序的序列進行BLASTx比對，然后用DNAMAN 8.0對抗藥性和敏感性野慈姑ALS基因片段序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 ALS基因片段的擴增與克隆

提取的野慈姑H4和S種群的DNA經紫外分光光度計檢測，OD260/OD280在1.7～1.9范圍內，表明DNA的純度達到了要求。用兩對引物擴增野慈姑不同種群的DNA，分別得到大約920 bp和730 bp的片段（圖1）。對PCR產物進行切膠回收后的產物與pUCT載體連接、轉化，對重組的質粒進行PCR鑒定，獲得的片段與最初的兩個PCR產物大小相同。

2.2 ALS基因片段測定結果

用DNAMAN 8.0將測序后的兩段序列拼接，得到的序列總長度為1 634 bp，編碼547個氨基酸，在NCBI中進行BLAST，與已經登記的野慈姑ALS基因序列同源性達到99%，證明擴增得到的野慈姑ALS基因序列是正確的。這段序列中不存在內含子，并且包含了在其他雜草中已經報道的8個氨基酸突變位點。將得到的抗藥性和敏感性野慈姑ALS基因片段和擬南芥ALS基因片段用DNAMAN 8.0進行對比，結果（表2）顯示，與敏感性野慈姑種群S相比，抗藥性種群H4在第197位脯氨酸都發生了突變，此位點由CCC突變成ACC（圖2），編碼蘇氨酸（Thr），所測得的10個植株在Pro197位都有相同的突變，在已經報道的Ala122、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654位點均沒有產生突變。

3 結論與討論

目前，被研制開發出來的不同結構的ALS抑制劑類除草劑最主要有五大類，即磺酰脲類（sulfonylurea， SU）、咪唑啉酮類（imidazolinone， IMI）、嘧啶硫代苯甲酸酯類（pyrimidinylthiobenzoate， PTB）、三唑并嘧啶類（triazolopyrimidine， TP）和磺酰胺羰基三唑啉酮類（sulfonylaminocarbonyltriazolinone， SCT），其中磺酰脲類、三唑并嘧啶類和咪唑啉酮類品種多，被廣泛推廣和應用[1215]。由于該類除草劑作用位點單一和大量的重復使用，抗該類除草劑雜草大量出現[16]。截至目前，世界各地已有159種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生了抗藥性[17]。

國內外有關野慈姑對ALS抑制劑類除草劑抗性機制的研究主要集中在高水平抗性的靶標位點突變上。Iwakami等[18]研究發現，日本秋田縣野慈姑R1和R2兩個種群對磺酰脲類除草劑產生了抗藥性，R1和R2對芐嘧磺隆及R1對吡嘧磺隆均表現高抗，其中抗藥性野慈姑種群R1與敏感性種群S1相比，ALS基因第197位氨基酸由脯氨酸（CCC）突變為絲氨酸（TCC），屬于靶標抗藥性（targetsite resistance， TSR）。Wei等[6]測定了東北地區兩個水稻田野慈姑種群對芐嘧磺隆的抗藥性水平，并通過與敏感種群ALS基因序列進行比較，確定ALS基因Pro197Leu和Pro197Ser突變引起抗藥性野慈姑ALS對該藥劑的敏感性降低，是引起其產生抗藥性的原因。

本研究通過對抗藥性及敏感性野慈姑ALS基因進行擴增、測序和對比后發現，抗藥性H4野慈姑種群的ALS基因第197位脯氨酸（Pro）被蘇氨酸（Thr）取代，這是第一次在野慈姑種群中被發現。ALS基因Pro197Thr取代導致雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗藥性在前人的研究中已得到證實。例如： 野蘿卜Raphanus raphanistrum L.、螢藺Scirpus juncoides （Roxb.）、播娘蒿Descurainia sophia L.和看麥娘Alopecurus aequalis Sobol.等，該突變是其對磺酰脲類除草劑產生抗藥性的分子基礎[1922]。因此，Pro197Thr是導致H4野慈姑種群對芐嘧磺隆產生抗藥性的重要原因之一。

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