花生網斑病不同病斑類型及其病原菌致病力差異

李紹建　高蒙　王娜　崔小偉　劉春燕　王振宇

摘要

本文描述了河南省發生日趨嚴重的花生網斑病在田間出現的一種新的病斑類型，并結合已報道的兩種病斑類型，對3種病斑類型的病原菌開展致病力差異研究。研究結果表明：田間新發現的花生網斑病病斑特征明顯，綜合分析后將花生網斑病病斑類型分別定為網紋型、類褐斑型和污斑型；同一花生品種上3種病斑類型病原菌菌株間存在明顯的致病力差異，同一病斑類型菌株對不同花生品種的致病力也表現出顯著差異。

關鍵詞

花生網斑病； 病斑類型； 病原菌； 菌株； 致病力差異

中圖分類號：

S 435.652

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017295

Different lesion types of peanut web blotch and virulence

differences of their pathogens

LI Shaojian， GAO Meng， WANG Na， CUI Xiaowei， LIU Chunyan， WANG Zhenyu

（Henan Key Laboratory of Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Crops in Southern Region of North China， Institute of Plant Protection，Henan Academy of

Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

A new lesion type of peanut web blotch caused by Peyronellaea arachidicola was described and the virulence differences of the pathogens resulting in different lesion types were investigated in this research. By a comprehensive analysis of the lesion features， three lesion types of peanut web blotch were sorted， including type of reticulate elongation， type of brown spot like and type of irregular stain. Furthermore， virulence test showed that virulence was significantly different not only among pathogens caused three lesion types on the same peanut cultivar， but also among the peanut cultivars caused by same pathogen with the same lesion type.

Key words

peanut web blotch； lesion type； pathogen； strain； virulence difference

花生Arachis hypogaea Linn.是重要的油料和經濟作物，其生產遍布世界各大洲100多個國家。目前，中國是世界上最大的花生生產、消費和貿易出口國，花生在我國國民經濟發展和對外貿易中占有重要地位[1]。河南省是中國傳統花生大省，其花生種植面積自2004年以來一直穩居我國第一位[23]。近年來，河南省花生網斑病發生日趨嚴重，造成葉片提早脫落，影響花生后期灌漿成熟，嚴重影響產量。

花生網斑病最早于1972在美國德克薩斯州發現[4]。在我國，該病于1982年在山東、遼寧等省的花生主產區首次發現，隨后陜西、河南等省也相繼報道了該病[56]。目前，普遍被學者接受的花生網斑病病原菌為花生莖點霉Phoma arachidicola，這一名稱最早是由Marasas等[7]于1974年研究南非發現的花生網斑病時據其形態學特征而命名的。一直以來，花生網斑病病原菌的屬級分類地位較為混亂，出現了許多不同的命名，直至2010年Aveskamp等[8]對莖點霉屬Phoma進行系統發育分析，將原莖點霉屬下的派倫霉節（section）升為派倫霉屬，并將花生網斑病病原菌歸到此屬，因此本文沿用上述最新的名稱花生派倫霉Peyronellaea arachidicola。

截至目前，有關花生網斑病發生危害及防治的研究報道較多，而對于其病原菌致病力的系統研究較少。有鑒于此，結合本課題組在田間調查時新發現的一種花生網斑病病斑類型，本文對花生網斑病3種病斑類型進行特征區分，并進一步對3種病斑類型的病原菌致病力差異開展研究，以期指導田間病害識別，并為病害的深入研究及抗性品系篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及花生品種

花生網斑病不同病斑類型病葉分別采集于河南省南陽市新野縣高廟鄉仁橋村（網紋型）、新野縣北王莊（類褐斑型）及河南省農業科學院原陽基地（污斑型），經室內組織分離并純化后保存菌株。

供試花生品種為‘開農1760、‘興花6號、‘豫花9327、‘豫花22、‘豫花15、‘遠雜9102。

1.2 病害癥狀描述

根據花生網斑病田間危害癥狀特點進行描述記載。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態特征

刮取病原菌菌落，顯微觀察，并參考《中國真菌志》[9]及《The genera of hyphomycetes》[10]描述其形態特征；將純化的病原菌菌株用PDA平板活化，25℃光照培養箱培養，觀察菌落顏色、形狀以及菌絲疏密程度等。

1.3.2 柯赫氏法則驗證

選用有6～8片真葉的‘豫花22進行致病性測定。病原菌接種采用菌絲懸浮液涂抹法（菌絲片段長度約100～200 μm，濃度為1.6×10-3g/mL），以清水接種為對照。每處理3次重復，每次重復6片復葉。接種后每片復葉套自封袋保濕，花生植株均置于28℃條件下培養，逐日觀察并記錄接菌植株葉片發病情況。

1.3.3 病原菌rDNAITS序列分析

采用上海萊楓生物科技有限公司的真菌基因組DNA小量提取試劑盒提取菌株基因組DNA。選用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）對病原菌基因組DNA進行PCR擴增。

PCR反應體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.0 μL，引物ITS1/ ITS4各1 μL， 模板DNA 1 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸50 s，32個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析。

1.4 致病力測定

1.4.1 接種體制備

分別挑取3種病斑類型的病原菌菌株移植于PDA平板中，25℃的光照培養箱（L∥D=12 h∥12 h）中恒溫培養10 d，隨后在超凈工作臺內分別將菌絲刮入裝有滅菌玻璃珠的2 mL PE離心管中，在離心管內加入200 μL無菌水，于Bullet Blender STORM研磨儀（Next Advance）8檔研磨45 s，取出研磨液并稀釋至菌絲濃度為1.6×10-3g/mL，按0.15%加入吐溫20后搖勻備用。

1.4.2 接種及調查

選取長勢一致的花生幼苗（苗齡20～30 d），采用菌絲懸浮液涂抹法接種，用無菌棉簽蘸取菌絲懸浮液，均勻涂抹到葉片正面，接種完成后做好標記并將每片復葉套封口袋保濕，所有接種的花生植株置于25℃的人工氣候箱（L∥D=12 h∥12 h）內培養，每個菌株接種設3次重復。

接種后14 d調查，記錄總葉數、發病葉片數，所有的發病葉片拍照留存，計算發病率及病情指數。葉片發病分級方法如下：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的6%以下；3級，病斑面積占整片葉面積的6%～25%；5級，病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7級，病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9級，病斑面積占整片葉面積的75%以上[11]。病情指數計算公式為：

病情指數=[Σ（相對級值×各級發病葉片數）/（調查總葉數×9）]×100。

1.5 數據分析

運用IBM SPSS Statistics 22軟件對文中數據進行單因素方差分析，顯著性測驗選用LSD法。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀描述

調查發現，河南省花生網斑病共可分為3種病斑類型：網紋型、類褐斑型和污斑型（圖1）。三者的病狀表現區分較為明顯，網紋型：病斑較大，直徑1～2 cm，在葉片正面形成邊緣網狀擴展，中間為褐色的病斑。病斑不規則，邊緣不清晰，一般不穿透葉片，田間發生往往多個病斑連在一起形成更大的病斑，嚴重時甚至可以遍布整片葉片（圖1a）；類褐斑型：病斑相對較小，直徑0.1～0.5 cm，近圓形，病斑中央黑褐色，邊緣清晰，周圍有黃色暈圈，可以穿透葉片（圖1b）；污斑型：病斑一般較類褐斑型大，直徑0.4～1 cm，病斑不規則形，黑褐色，邊緣清晰，周圍無黃色暈圈，可以穿透葉片（圖1c）。

2014年-2016年對花生網斑病的采樣結果顯示，在河南省境內，花生網斑病的3種病斑類型以網紋型分布最廣，類褐斑型次之，污斑型分布最少。類褐斑型與污斑型分布地區相對重合，目前僅在新鄉、焦作、洛陽和南陽四市范圍內采集到病害樣本（圖2）；對不同地區3種病斑類型的發病率調查數據顯示，3種病斑類型在河南省境內均分別表現為由南向北發病率逐漸升高的趨勢，并且隨2014年至2016年的時間順序，3種病斑類型田間發病率均分別逐年降低（表1）。

2.2 病原菌鑒定結果

2.2.1 病原菌菌落形態特征

3種病斑類型的病原菌在PDA培養基上的菌落特征存在差異。網紋型病原菌菌絲致密，灰白色，菌落邊緣內側有輪紋；類褐斑型病原菌菌絲較稀疏，菌落中央菌絲淺綠色，外圍灰白色，菌落邊緣菌絲生長茂盛，內側有輪紋；污斑型病原菌菌絲致密，灰白色，菌落中央氣生菌絲茂盛，菌落邊緣菌絲生長茂盛，內側無輪紋（圖3）。在實驗室內相同條件分別繼代培養后，3種病斑類型的病原菌菌落特征穩定。

2.2.2 柯赫氏法則驗證結果

3種病斑類型的病原菌均引起花生葉片發病，而相應的清水對照處理的葉片均未發病。接種15 d后，3種病斑類型病原菌接種的花生葉片均分別表現出與原病斑類型一致的癥狀；分別取3種病斑類型的葉片進行再次分離，均獲得了與原菌株相同的病原菌，證明3個類型的菌株均為花生網斑病的致病菌且回接后葉部癥狀表現與原病斑類型一致。

2.2.3 病原菌rDNAITS序列分析結果

利用引物ITS1/ITS4分別對3種病斑類型的病原菌進行rDNAITS序列擴增，均擴增出大小為530 bp的條帶（圖4）。將測序所得序列上傳至NCBI進行BLAST比對分析，結果顯示，3種病斑類型的病原菌均與GenBank登錄號為JX898682的花生派倫霉Peyronellaea arachidicola，即目前普遍被學者接受的花生莖點霉Phoma arachidicola序列相似性達到99%，因此鑒定3種病斑類型的病原菌均為花生派倫霉Peyronellaea arachidicola。

基于3種病斑類型病原菌的ITS序列，用Clustal X（1.83）[12]多序列對位排列程序對3個序列進行對位排列，由分析結果可知，3種病斑類型病原菌的ITS序列完全一致。

2.3 不同病斑類型病原菌菌株的致病力

通過菌絲懸浮液涂抹接種法，將花生網斑病3種不同病斑類型的病原菌菌株分別接種在6個河南省花生主栽品種上，對菌株的致病性進行測定。接種7 d后，網紋型病原菌菌株接種葉片上顯現不規則的黑色小病斑，病斑邊緣不明顯且呈不規則網狀延伸；類褐斑型病原菌菌株接種葉片上顯現近圓形褪綠斑，隨著病斑發展，病斑中央褐色，周圍有黃色暈圈；污斑型病原菌菌株接種葉片上顯現不規則的黑色病斑，病斑中央黑色，邊緣分界明顯。

不同病斑類型的病原菌菌株對不同的花生品種表現出不同的致病力（表2）。接種網紋型菌株的6個花生品種全部發病，其中發病率最高為‘豫花9327，達95.00%，病情指數最高為‘開農1760（17.78），發病率與病情指數最低均為‘遠雜9102；接種類褐斑型菌株的花生品種中，除‘興花6號沒有發病外，其他5個品種均發病，‘遠雜9102上的發病率與病情指數分別為10.00%和0.56，相較其他品種均較低，發病率與病情指數最高均為‘豫花22；接種污斑型菌株的6個花生品種全部發病，其中發病率與病情指數最高均為‘開農1760，分別為90.00%和22.22，最低均為‘遠雜9102，分別為50.00%和9.36。另外，除接種類褐斑型菌株的‘豫花22上發病率與病情指數均高于接種網紋型的菌株外，其他品種上均表現為接種類褐斑型菌株的發病率和病情指數最低。

3 結論與討論

目前，文獻報道的花生網斑病田間表現型通常有兩種：一是污斑型，病斑較小，近圓形，周圍有黃色暈圈；另一種是網紋型，病斑較大，病斑網紋狀或星芒狀，病斑不規則形，邊緣不清晰，周圍無黃色暈圈[13]。本研究通過田間采樣調查，發現一種新的花生網斑病的病斑類型，病狀表現為病斑相對較小，不規則形，邊緣清晰，周圍無黃色暈圈。經室內分離、柯赫氏法則驗證及ITS測序，證實新發現病斑類型確為花生網斑病所致病癥。文獻表述的污斑型周圍有黃色暈圈，在田間識別時與花生褐斑病難以區分；本文新發現病斑類型周圍雖無明顯黃色暈圈，但其余特征均與文獻報道污斑型病狀相似。因此，為更好指導田間花生網斑病識別，本文擬將之前文獻報道原污斑型改為類褐斑型，新發現病斑類型擬定為污斑型，網紋型保持不變，即花生網斑病病斑的3種表現類型：網紋型、類褐斑型和污斑型。基于本研究中2014年至2016年花生網斑病病斑類型的調查數據，3種病斑類型在河南省境內3年內均分別表現為由南向北發病率逐漸升高的趨勢，說明花生網斑病近3年來在河南省的發病規模正不斷擴大，對3種病斑類型在地理上的發病趨勢還有待進一步深入研究。

一直以來，關于花生網斑病病原菌的屬級分類比較混亂。自1974年西方學者Marasas等在南非發現花生網斑病并據其形態學特征將該菌定名為莖點霉屬一新種——花生莖點霉Phoma arachidicola Marasas， Pauer & Boerema[7]以來，針對該菌曾陸續有過Mycosphaerella arachidicola Chochrjakov， M. argentinensis Frezzi， Didymella arachidicola （Chochrjakov） Tomilin， D. arachidicola （Chochrjakov） Taber， Pettit & Philley和Didymosphaeria arachidicola （Chochrjakov） Alcorn， Punithalingam & McCarthy的不同命名[14]。隨著近代分子生物學技術的發展，2010年Aveskamp等[8]通過對莖點霉屬真菌進行系統發育分析，將原來莖點霉屬Phoma下的派倫霉Peyronellaea節（section）及另外一些節的真菌歸類并升為派倫霉屬，花生網斑病病原菌即被劃至此屬內。因此，本文中花生網斑病病原菌使用拉丁學名為Peyronellaea arachidicola。

對不同病斑類型菌株致病力研究結果表明，同一病斑類型菌株對不同花生品種的致病力差異明顯。以田間危害范圍最廣的網紋型菌株為例，網紋型菌株對‘開農1760、‘興花6號和‘豫花9327的致病力相對較強，而對‘豫花22、‘豫花15和‘遠雜9102的致病力相對較弱。綜合分析3種病斑類型對不同品種的致病力，可知‘遠雜9102為對3種病斑類型菌株抗性均較好的花生品種。此外，不同病斑類型菌株對同一花生品種的致病力差異也十分明顯，在‘開農1760、‘豫花15及‘遠雜9102上均表現為污斑型>網紋型>類褐斑型；在‘興花6號和‘豫花9327上表現為網紋型>污斑型>類褐斑型；而在‘豫花22上，污斑型菌株的致病力最強，類褐斑型次之，網紋型最弱。這說明在供試的6個花生品種中，除‘豫花22外，污斑型和網紋型的致病力均明顯大于類褐斑型。董煒博等鑒定了來自中國山東、河南、遼寧、湖北和美國的20多個花生品種（系）對花生葉部病害的抗性[15]，袁虹霞等測定了河南13個花生品種（系）對褐斑病、黑斑病和網斑病的抗性[16]，結果均表明供試品種中缺乏免疫和高抗花生網斑病的花生品種（系）。近年來，花生網斑病的發生危害規模逐漸增大，危害程度逐年加深，加之抗性品種（系）相對缺乏，因此生產上急需一批抗性良好的花生品種（系）來改善花生生產現狀。本文結合花生網斑病病斑類型分布特點，分病斑類型進行花生抗性品種（系）的篩選，將為花生抗性品種（系）選育及品種推廣提供一種新的思路。

本文研究結果明確了田間花生網斑病的3種不同病斑類型以及其在河南省各地區的分布情況，這極大地方便了花生網斑病的田間識別調查。同時還創造性地對3種不同病斑類型病原菌菌株開展了致病力差異研究，為更好地研究花生網斑病發生發展規律、田間防治及花生品種推廣提供了重要的理論依據。

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（責任編輯：楊明麗）