甘藍抗軟腐病離體鑒定方法探究

馬燕勤 李勤菲 司軍

摘要 通過分析不同因素對甘藍軟腐病離體接種后發病效率的影響，建立了一套甘藍軟腐病抗性的快速鑒定方法。結果發現，用濃度為6.4×10.8 cfu/mL的軟腐病液體培養基懸浮液，采用針刺法接種苗齡為5～7葉期植株的離體葉片，接種后空氣濕度為90%以上是最有利于軟腐病發病的方法。利用該方法鑒定27份栽培甘藍，發現高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份。

關鍵詞 甘藍； 軟腐病； 離體抗性鑒定

中圖分類號： S 436.33

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017460

Abstract A multifactor experiment with three duplicates was established to investigate three different inoculation techniques （transaction inoculation， injection and pin prick） by using pathogenic isolates ofPectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum in China against resistant and susceptible cabbage cultivars under controlled greenhouse conditions. It was found that the method with the pathogen suspended in the liquid NA medium at the density of 6.4×10.8cfu/mL， inoculating plants at the seedling age of 5-7-leaf old by pin prick in the growth chamber with a high moisture of over 90%， was suitable for the pathogen to infect the cabbage leaves. This method was used to identify resistance to soft rot in 27 cabbage cultivars， three of which showed high resistance， eight moderate resistance， eight tolerance and eight susceptibility to soft rot.

Key words cabbage； soft rot； resistance identification

甘藍軟腐病，又稱水爛、爛疙瘩，是甘藍包心后期的主要病害之一，可使甘藍嚴重減產，甚至絕收，而且在收獲、運輸、儲藏、銷售等過程中還可繼續腐爛，造成極大損失[1]。病害從傷口部開始發生，初期呈現浸潤狀半透明，以后病部逐漸擴展成明顯的水潰狀，表皮下陷，有污白色細菌溢膿，并散發出惡臭。重病植株的葉柄基部和根莖處組織完全腐爛，病株變得一踢即倒，一拎即起[2]。植物細菌性軟腐病的主要致病菌為果膠桿菌Pectobacterium spp.。該菌可侵染至少16種雙子葉植物和11種單子葉被子植物[3]。該屬目前被劃分成4個種，P.carotovorum（Pc），P.atrosepticum （Pa），P.betavasculorum（Pb）和P.wasabiae（Pw）[4]。與后三個種相比，Pc表現出高度多樣性[5]，可進一步描述為3個亞種：P.c.subsp.carotovorum（Pcc），P.c.subsp.odoriferum（Pco）和P.c.subsp.brasilience（Pcb）[6]。

Pcc是自然條件下普遍存在的、寄主范圍和地理分布最為廣泛的植物病原菌[7]，能侵染溫帶和亞熱帶種植的馬鈴薯、白菜、甘藍等數百種蔬菜和某些花卉植物[8-9]，2011年馬來西亞學者報道稱甘藍軟腐病的致病病原菌為Pcc[10]。甘藍Brassica oleracea L.作為一種主要的蔬菜作物在我國各地廣泛栽培，近年來隨著國內周年供應需求及出口貿易的增加，甘藍種植面積逐年擴大，現已達到了每年90萬hm.2，成為占據國內市場主導地位的蔬菜之一。對軟腐病的防治有多種方法，例如生物學方法防治，有報道稱乳酸菌[11]能有效防治田間軟腐病；物理防治，如γ射線[12]；而培育和選育抗病品種也是防治植物病害的重要措施，植物品種抗病性的鑒定是抗病育種的一項關鍵技術。

本試驗參考大白菜軟腐病抗性鑒定方法[13-15]，通過對現有甘藍種質資源的抗性進行苗期室內鑒定探究，旨在找到一種快速簡單的甘藍軟腐病抗性鑒定方法，并對甘藍資源材料進行初步鑒定，為甘藍抗軟腐病綜合育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc），采購于中國微生物官網。

供試品種：由西南大學十字花科蔬菜研究室提供的有明顯抗性差異的3個材料R1、R2和R3，以及該實驗室種質資源圃自交系穩定的24份材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘藍育苗

育苗工作在封閉完好的防蟲玻璃溫室內進行。使用高溫滅菌的營養土及4孔×8孔的穴盤育苗，選擇充實飽滿、發芽勢一致的種子，每穴2粒，覆土厚度0.8～1.0 cm。每個材料育30株，苗齡在5～6葉期時接種。

1.2.2 菌懸液的制備

在苗期抗性鑒定前2 d，用NA液體培養基制備菌懸液，菌懸液放在28℃的搖床上培養24 h，采用血球計數板計數[16]，根據各試驗的需要分別配制為含菌量6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9 cfu/mL的菌懸液，供接種鑒定用。

1.2.3 最佳接種濕度的確定

采用針刺法研究接種后不同濕度對甘藍軟腐病的影響。甘藍品種為‘京豐一號。在甘藍苗齡為 5～6葉期時取健康外葉，每個處理采摘10株，每株采摘3片葉，用流水沖洗1 min，然后用75%的乙醇溶液處理30 s，再用無菌水漂洗3遍，將處理后的離體甘藍葉片排入 20 cm×15 cm×6 cm的塑料盒中，用大小相同的針10根捆成一束在離體葉片的葉脈基部針刺，用移液管或槍吸取10 μL濃度為6.4×10.9cfu/mL的菌懸液緩慢地注入傷口表面，接種后置于空氣濕度分別為50%～60%、70%～80%、90%～100%的條件下，72 h后調查、記錄發病程度。

1.2.4 接種苗齡、方法和接種液的確定

以R2為材料，采用L9（3.4）正交設計[17-18]。分別設置接種苗齡、接種方法和接種液3個因素，每個因素設置3個水平（表1），試驗重復3次。接種用菌懸液濃度為64×10.9cfu/mL。

1.2.5 最佳接種濃度的確定

將Pcc菌懸液配制成6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9cfu/mL 3個不同濃度的菌懸液，利用篩選出的苗期人工離體接種方法、苗齡和接種液，接種3個有抗性差異的材料R1、R2、R3。相對濕度為確定的最佳接種濕度。

1.2.6 病情分級標準的制定

參考大白菜[17-18]和擬南芥[19]軟腐病單株分級標準，并根據預試驗中甘藍離體葉片被軟腐病病原菌侵染后出現的表型，將病情劃分為6個級別。0級：接種點無侵染病癥；1級：病斑剛開始形成，呈水浸狀；3級：病斑長度<1 cm；5級：1 cm≤病斑長度<2 cm；7級：2 cm≤病斑長度<3 cm；9級：病斑長度≥3 cm或者葉柄大部或全部腐爛。

1.2.7 群體分級標準

分級標準參照“九五”國家攻關組制定的病毒病和霜霉病的群體分級標準。免疫（I）： 病情指數為0.00；高抗（HR）： 0.00<病情指數≤11.11；抗病（R）： 11.11<病情指數≤33.33；耐病（T）： 33.33<病情指數≤55.55；感病（S）： 55.55<病情指數≤77.77；高感（HS）： 77.77<病情指數≤100。

病情指數=100×∑（各級病株數×各級代表值）/（總株數×最高級代表值）。

1.2.8 27份材料的抗性鑒定

根據預試驗得出的最佳接種方法對27份現有的甘藍種質資源進行抗病性鑒定。

2 結果與分析

2.1 甘藍軟腐病離體抗性鑒定方法

2.1.1 不同接種濕度對甘藍軟腐病發病的影響

采用針刺法研究接種后不同濕度對甘藍軟腐病發病的影響。對3個相對濕度下的病情指數進行方差分析，結果表明F值為26.94，F>F0.01=18.00， 因此需要對3個接種濕度做顯著差異性分析，結果見表3。

從表中可以看出， 接種濕度在90%～100%時甘藍軟腐病的病情指數最高，極顯著高于接種濕度為70%～80%和 50%～60%的病情指數；接種濕度為70%～80%的病情指數顯著高于接種濕度為50%～60%的病情指數。由此可以得出：空氣相對濕度高有利于甘藍軟腐病的發生。

2.1.2 接種方法、苗齡、接種液對甘藍軟腐病發病的影響

從方差分析來看苗齡（A因素）、接種方法（B因素）的F值分別為12.19和20.62，達到極顯著水平，接種液（C因素）的F值為4.48，達到顯著水平。從表4還可以看出接種方法較苗齡和接種液而言，影響最大，苗齡次之，接種液的影響最小。由于試驗前不能確定三因素間有無明顯交互作用，三因素的各水平間無法進行差異比較，因此本試驗主要是確定不同處理組合間的差異比較，對組合進行新復極差檢驗。

從表4可以看出，第9個處理組合（7～8片真葉，針刺法，50%無菌水+50%液體NA培養基菌懸液）和第6個處理組合（5～6片真葉，針刺法，接種液為無菌水菌懸液）的接種效果最好，病情指數累積值分別為222.41和212.33，兩者之間沒有顯著差異；其次在試驗中發現NA培養基菌懸液有利于其黏著在甘藍葉片表面，并且接種液對試驗結果影響很小，所以最終選擇NA液體培養基菌懸液為最佳接種液。

2.1.3 不同接種濃度對甘藍軟腐病發病的影響

從表5可知，用6.4×10.7 cfu/mL濃度接種后72 h，3個材料均表現為抗性（R），用6.4×10.8 cfu/mL濃度接種后有一個材料表現為抗性（R），兩個材料表現為耐病（T），而用6.4×10.9cfu/mL濃度接種后有一個材料表現為耐病（T），兩個材料表現為感病（S），雖然從數據上看6.4×10.8cfu/mL的接種濃度未能將不同抗性的材料區分開，但是在試驗圖片中是可以將三者區分開的（圖片未展示），因此認為菌液孢子含量6.4×10.8cfu/mL是最佳接種濃度， 接種后72 h調查最佳。

2.2 甘藍種質資源抗性鑒定

采用上述方法對 27份西南大學十字花科研究所的甘藍種質資源進行鑒定。結果篩選出高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份，無免疫和高感材料（表6）。

3 小結與討論

3.1 小結

通過對接種苗齡、接種方法和接種液進行3因素3水平的正交試驗，得出最佳接種苗齡為5～7葉期、最佳接種方法是針刺法、適宜接種液為液體培養基菌懸液，最佳接種濃度為6.4×10.8 cfu/mL，病情指數調查均在接種后72 h，葉片反面接種，接種部位為葉片主脈中部并且接種的最佳保濕條件為空氣相對濕度 90%以上。

3.2 接種濕度是離體接種鑒定方法的重要條件

據報道，空氣濕度[20-21]是影響大白菜軟腐病發生程度的重要條件，本試驗發現，甘藍離體葉片接種后軟腐病的發生也需要相對濕度達到較高的水平，只有空氣相對濕度保持在90%以上時才能導致軟腐病斑的形成。

3.3 接種方法、苗齡和接種液對軟腐病發病的影響

在探究接種方法、苗齡和接種液對軟腐病發病的影響時本試驗采用了正交設計，這樣既減少了試驗內容，同時也能夠對濃度、苗齡和接種方法3個因素同時進行考察。試驗表明，用大小相同的針10根捆成一束在離體葉片的葉脈基部針刺法是離體接種軟腐病菌的最佳接種方法。試驗發現，采用刀片橫切法接種，傷口發病程度較輕，可能原因是傷口太大，傷口木栓化不利于發病并且刀切法在試驗中不好控制，最后無法判斷是否是因為感染病菌而導致的發病；注射法也不好控制，而且由于傷口較小，不利于軟腐病菌侵染。關于苗齡對接種的影響，作者認為苗齡太小，不利于發病，而苗齡在5～6片葉和7～8片時接種并沒有表現出太大的區別。所以最終確定接種鑒定的苗齡期為5～7片真葉期。本文結果表明，3種不同接種液對軟腐病發病的影響差異不顯著，但采用液體NA培養基菌懸浮液接種時軟腐病發病程度好于其他兩種方法，可能是因為是液體NA 培養基有利于病菌黏附在甘藍離體葉片表面。

3.4 接種濃度對離體鑒定的影響

接種體的菌懸液濃度是影響軟腐病發生的重要因素，本研究表明，菌懸液中病菌含量為64×10.8cfu/mL是最佳接種濃度。

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（責任編輯：楊明麗）