黑龍江地區農田害鼠發生特點及DNA條形碼鑒定技術的應用

李爭光 叢林 王大偉

摘要 黑龍江地區為我國最大的商品糧生產基地之一，鼠害是影響該地區糧食生產的重要因素之一。為了解當地農田害鼠種類、密度及分布特征，本研究于2010-2011年對該省主要作物田的嚙齒類動物開展調查，并利用細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）對害鼠種類進行鑒定，分析該地區農田害鼠種類分布和發生特點，為其防治提供基礎數據和方法依據。結果表明，所捕獲的害鼠經形態鑒定可分為2科7屬7種，分別為鼠科的黑線姬鼠、巢鼠、褐家鼠和小家鼠，以及倉鼠科的大倉鼠、黑線倉鼠和東方田鼠。DNA條形碼分類結果與形態分類結果一致，但是在近緣種間的區分上還需要與形態數據相結合。黑龍江地區農田害鼠密度呈現出“春低秋高” 的時間特征，并且在玉米田中最高；在鼠種特征上，黑線姬鼠為廣布種和優勢種，其他鼠種則在局部地區密度較高。根據上述結果，應將春季作為黑龍江地區農田害鼠的重點防治時期，重點作物為玉米，同時應重點關注大中型鼠的數量變動情況。

關鍵詞 黑龍江省； 農田害鼠； DNA條形碼； 物種鑒定； 分布特征

中圖分類號： S 443

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018001

Abstract Heilongjiang Province is the largest commodity grain base of China， and huge damage caused by pest rodents is a key factor affecting local crop production. However， few studies were conducted to investigate the basic characteristics of local pest rodents including taxonomy， distribution and population density in the agricultural areas in Heilongjiang Province. In this study， we surveyed pest rodents from six sites covering three kinds of typical crop farming regions in Heilongjiang Province， and identified the species using DNA barcoding （cytochromeCOⅠ gene）. Seven species were identified belonging to seven genera of 2 families by both DNA barcoding and morphological characterization， includingApodemus agrarius，Microtus fortis， Mus musculus， Tscherskia triton， Cricetulus barabensis， Micromys minutus，andRattus norvegicus. Among them，A. agrariusis the dominant species and widely distributes in whole province. Compared with the population density in spring， it was significant higher in autumn， indicating the overt seasonal breeding of local rodents. Moreover， the population density in maize farmland was higher than that in rice and soybean ones. Therefore， rodent management in Heilongjiang Province should be focused on spring season， maize farmlands， and the rodent species with middle or large body size， such as hamsters and Norway rat.

Key words Heilongjiang Province； pest rodent in farmland； DNA barcoding； species identification； distribution characteristics

鼠害是世界范圍內常見農業災害之一，給農、林、牧業都帶來了巨大的損失。20世紀80-90年代是我國鼠害發生最嚴重的時期，全國農業鼠害發生省份最多可達27個，發生面積近2 467萬hm.2，約占全國耕地總面積的24.6%，糧食損失最高超過1 500萬t/年[1]。近10年來，全國農區鼠害發生維持在中等至中等偏重趨勢，東北地區農田鼠害發生則常年保持在偏重狀態[2-7]。隨著種植結構調整，東北地區已經成為我國最大的商品糧生產基地。黑龍江省地處我國最北端，耕地面積超過1 300萬hm.2，人均耕地面積0.31 hm.2，位居全國之首。早在20世紀50-60年代就有關于黑龍江林區和平原鼠類研究的報道[9-11]，但專門針對農田鼠害的研究在近幾年才逐步受到重視[12-14]。已有學者對東北地區嚙齒動物種類和區系進行了研究[13-18]，然而針對黑龍江地區農田害鼠的主要種類及其發生和分布特征研究的較少，對其主要鼠種特征及發生規律尚不明確。

DNA條形碼技術是指用DNA上一段標準的小DNA片段來鑒定物種的一項分子鑒定技術，最早由Hebert等在2003年提出，被廣泛用于物種的鑒定，尤其是對于形態相似的近緣種[19]。目前廣泛用于動物條形碼研究的分子標記主要是線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ （cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）[20-26]。該技術也被廣泛用于嚙齒類動物的鑒定和檢驗檢疫。利用COⅠ 作為DNA條形碼，劉潤吉等[20-21]在貴州茂蘭和黑龍江黑瞎子島兩地對當地主要害鼠種類進行鑒定，有效區分出外形相似的鼠種；閆東等[23]鑒定了河北省鼠疫疫源的主要鼠種；普麗婭等[24]將來自津巴布韋的集裝箱內的鼠類殘骸鑒定為黑鼠Rattus rattus。這些研究表明，DNA條形碼技術是形態學鑒定的有力補充。

因此，本研究重點調查了黑龍江各主要農區鼠類發生情況，結合DNA條形碼技術進行種類鑒定，并分析農田害鼠發生和分布的時空特征，以期闡明黑龍江地區農田害鼠分布和發生情況，為當地農田害鼠防治提供基礎數據和防治依據。

1 材料與方法

1.1 鼠類樣品采集

本研究調查覆蓋黑龍江各主要農區，包括東部三江平原農作區（佳木斯市富錦市）、中部山區農作區（哈爾濱市雙城區、哈爾濱市道外區、哈爾濱市尚志市）和西部松嫩平原農作區（大慶市杜蒙縣、綏化市北林區）。鋏捕率調查主要采用“鋏夜法”，在秋季水稻田中則采用“盡捕法”。鋏夜法根據農業行業標準NY/T 1481-2007《農區鼠害監測技術規范》要求，在樣地鄰近地塊進行鋏線法，將中號鼠鋏（140 mm×55 mm）按5 m一鋏布于農田邊緣，次日清晨收鋏，記錄捕獲的害鼠種類及其數量；盡捕法則利用自制工具將從稻堆中逃出的老鼠處死，記錄數量、種類[12]。2010-2011年調查地點經緯度及生境情況見表1。

1.2 形態鑒定

在現場根據外部形態特征進行初步鑒定，將獲得標本冷凍后帶回實驗室測量外部形態，制作頭骨并對頭骨形態進行觀察和測量，根據檢索表[15]對形態鑒定結果進行確認。

1.3 DNA條形碼分析及鑒定

1.3.1 基因組DNA提取及PCR

利用TIANamp Genomic DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取鼠類腳趾或尾巴的DNA，-20℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增與測序

設計通用引物（BatL5310，R6036R）[27]擴增每個樣本的COⅠ基因片段。PCR反應體系為：25 μL體系，Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板1.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸10 min。PCR擴增產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Illumina 3730測序儀進行雙向測序。

1.3.3 DNA序列分析

釆用Lasergene 7.0軟件查看測序結果的峰圖，對序列進行人工校正[28]；再用DnaSP 5.0軟件分析變異位點數目，并對序列進行單倍型分析[29]。最后用MEGA 7.0軟件中基于Kimura-2-parameter（K-2-P）的遺傳距離用鄰接法（neighbor-joining）構建系統進化樹，重復檢驗值（bootstrap）設置為1 000，并比較不同鼠類種群內和種群間個體的遺傳距離[30-33]。以三趾跳鼠Dipus sagitta（NCBI 登錄號NC_027499.1）的COⅠ序列作為外類群。

1.4 農田鼠類發生規律分析

根據形態學和條形碼鑒定結果，統計黑龍江省6個地區（佳木斯市富錦市長安鎮、哈爾濱市雙城區紅旗鄉、哈爾濱市道外區民主鄉、哈爾濱市尚志市帽兒山鎮、大慶市杜蒙縣一心鄉和綏化市北林區白魁鎮）不同害鼠種類在春季和秋季的鋏捕率，分析不同鼠類的季節性發生特征；分析不同作物（大豆、玉米和水稻）田間鼠類的優勢種類以及鼠在不同作物田間的分布特點。

2 結果與分析

2.1 各地農田鼠形態鑒定

在6個地區共采集完整鼠類樣品340只，形態鑒定為2科7屬7種，分屬于鼠科中的姬鼠屬、巢鼠屬、大鼠屬、小鼠屬，以及倉鼠科中的大倉鼠屬、倉鼠屬、田鼠屬（表2）。

2.2 DNA條形碼分析

從收集的340只鼠類樣品中挑選來自7個屬7個種112只鼠進行COⅠ序列擴增和測序。對獲得的112條序列進行比對分析發現220個變異位點（variable sites），其中216個是系統發育信息位點（parsimony informative sites）。單倍型分析表明112個COⅠ序列中有41個不同的單倍型。將其與NCBI中的參考序列進行比對分析表明，其分屬于7個鼠種，與對應物種的相似性 >98%。進一步利用MEGA軟件分析所采集樣本不同鼠種間和種內的遺傳距離（genetic distance），結果表明7個鼠種的種間遺傳距離（16.17%～25.21%） 遠遠大于種內遺傳距離（0.22%～2.69%）。（表3）

利用鄰接法（neighbor-joining）對41個COⅠ序列單倍型進行系統發育分析表明，同一種的鼠類聚為一支，支持率均為100%（圖1）。整個系統樹分為3個明顯的大支，其中鼠科一支的支持率為54%，包括黑線姬鼠、巢鼠、褐家鼠、小家鼠；第二大支的支持率為93%，包含倉鼠科中的大倉鼠、黑線倉鼠；來自倉鼠科中田鼠亞科的東方田鼠單獨聚為一支，支持率為100%。（圖1）

2.3 黑龍江農田害鼠發生規律分析

2.3.1 季節規律

對黑龍江地區春秋兩季的鋏捕數據進行統計后發現，春季（5-6月）收回有效鋏1 380個，共捕到鼠83只，鋏捕率為6.0%，秋季（9-11月）收回有效鋏1 924個，共捕到鼠375只，鋏捕率為19.5%。秋季鋏捕率大約為春季鋏捕率的3倍以上，呈現出“秋高春低”的時間分布特征。

2.3.2 分布特點及優勢鼠種分析

采用秋季鋏捕數據分析表明：在不同的農作物間，玉米田中鋏捕率最高，為25.1%，大豆田次之，為15.3%，水稻田最低，為12.1%；玉米田中鋏捕率可達其他兩種作物的2倍左右。黑線姬鼠為各種農田中的絕對優勢種，在3種作物田占樣本數比例均達到60%以上；褐家鼠在3種作物田中均有分布，且數量較為穩定， 在10%左右；東方田鼠主要分布在水稻田，高達20%，遠遠大于其他兩種作物田的密度；大倉鼠主要分布于大豆和玉米田；小家鼠及黑線倉鼠則在3種作物田里極少分布，均不超過5%（表4）。

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（責任編輯：楊明麗）