鐵皮石斛炭疽病病原菌的分離鑒定及其有效殺菌劑的篩選

趙玲琳 王國榮 沈偉東

摘要 鐵皮石斛炭疽病是近年來發生在浙江鐵皮石斛種植區的一種嚴重病害，主要危害石斛的葉片，形成圓形或近圓形并有凹陷的黃褐色或黑色葉斑，嚴重時葉片枯死，影響鐵皮石斛的產量和質量。通過對鐵皮石斛炭疽病典型癥狀樣本的采集、病原菌的分離、純化、致病性測定、形態觀察、rDNA-ITS序列分析， 明確病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。選擇11種殺菌劑采用生長速率法對病原菌進行了藥劑敏感性測定， 結果表明，6%春雷霉素可濕性粉劑 1 000倍液、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 000倍液對病菌抑菌效果接近100%。

關鍵詞 鐵皮石斛； 膠孢炭疽菌； 春雷霉素

中圖分類號： S435.672

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018035

Abstract In recent years， anthracnose ofDendrobium officinale has become a serious disease inD. officinale producing areas of Zhejiang Province. It mainly infects the leaves and forms round or nearly round， dark brown or black sunken spots. In serious cases， it causes the leaves to wither. In this study， samples with typical disease symptoms were collected and then the pathogen was isolated and purified. Based on pathogenicity test， morphology observation and 16S rDNA-ITS sequence analysis， the pathogen was identified to beColletotrichum gloeosporioides. Moreover， the indoor inhibition activities of 11 kinds of fungicides were investigated by mycelial growth rate method. The results showed kasugamycin 6% WP 1 000 times and thiophanate-methyl 70% WP 1 000 times had strong inhibition action to the pathogen， with the inhibitory ratio close to 100%.

Key words Dendrobium officinale； Colletotrichum gloeosporioides； kasugamycin

鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimuraet Migo是名貴中藥材，被譽為“中華九大仙草”之首， 鐵皮石斛中的多糖成分，具有提高人體免疫力、抗氧化和抗腫瘤的功效[1]。鐵皮石斛野生資源稀少，隨著對其需求量的增加，人工栽培鐵皮石斛已相當普遍[2]。其中，大棚設施栽培是最主要的栽培模式，但大棚內高溫高濕的環境，非常有利于病害的發生[3]。浙江省是鐵皮石斛的主要種植區，產業化基地已超過100個， 種植面積高達2 000 hm.2，產值超過30億元[2]。近年來，我們對浙江省鐵皮石斛基地進行病蟲害調查時發現，除了莖基部的莖腐病、白絹病、軟腐病和疫病等病害外[3-6]，還有危害葉片的炭疽病、黑斑病[7]和葉斑病[8]等病害。我們在田間調查時發現青稈型鐵皮石斛炭疽病葉發病率通常為25%，有的大棚達75%，嚴重影響鐵皮石斛的產量與質量。在查閱文獻時也發現炭疽病是鐵皮石斛葉部的主要病害之一[9-10]， 據報道引起鐵皮石斛炭疽病的病原菌有多種， 趙桂華等人[11]的研究表明引起江蘇句容鐵皮石斛炭疽病的病原菌是黑線炭疽菌Colletotrichum dematium， 李海明等[12]認為引起福建連城等地的鐵皮石斛炭疽病是辣椒炭疽菌C.capsici， 邱道壽等[3]認為引起珠三角鐵皮石斛炭疽病的病原菌是C.phalaenopsis 或膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。上述除趙桂華等[11]對鐵皮石斛炭疽病的病原菌作了詳細研究外， 其余對炭疽病的病原菌尚未作過詳細研究。為了明確引起浙江鐵皮石斛炭疽病的病原菌， 更好地指導鐵皮石斛生產與開展抗病育種研究，為鐵皮石斛病蟲害的綠色防控提供理論基礎，本文著重就引起浙江省鐵皮石斛炭疽病癥狀與病原鑒定進行研究。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌分離

2014-2016年連續在杭州市、溫州市、金華市等鐵皮石斛基地進行田間調查，采集葉片上出現黃褐色、黑色圓形或近圓形斑的鐵皮石斛樣本，裝入干凈樣本袋中，帶回實驗室進行病原菌的分離。取病健交界處組織，置于75%乙醇中1 min，再用1% NaClO表面消毒3 min，然后重新置于75%乙醇中漂洗30 s，最后將組織塊在無菌水中漂洗5次，用滅菌濾紙吸干水分并移入PDA平板上，25℃恒溫培養箱內黑暗培養。待菌落長出后即從菌落邊緣挑取極少量菌絲轉接至新的PDA培養基上進行純化，并在4℃冰箱內保存備用。

1.2 病原菌致病性測定

健康盆栽鐵皮石斛苗由杭州正德農業開發有限公司提供，置于溫室中，定時定量澆水和澆灌營養液，供致病性測定用。選擇分離純化得到的代表性菌株CG1在PDA培養基上培養1個月后，采用針刺加噴霧接種法進行接種試驗：首先配制濃度為1 ×10.7個/mL的孢子懸浮液，再用針尖輕輕刺破石斛葉片表皮，造成微傷口，將含有吐溫-20的孢子懸浮液以霧狀噴灑于莖稈中間健康成熟葉片上，后用塑料袋套袋保濕48 h。每個處理接種5盆，每盆接種4枝莖，每枝莖6片葉片。對照組用無菌水代替孢子懸浮液。將接種后的植株置于人工氣候培養室中（25℃，L∥D=12 h∥12 h，90%相對濕度）。定期觀察發病情況并記錄結果，待發病后從病組織處再次分離純化病原菌。

1.3 病原菌的形態學特征觀察

將分離純化的菌株CG1，CG2，CG3，CG4和CG5在PDA平板上培養，在25℃黑暗人工氣候箱內長滿平板后，觀察菌落形態特征，在顯微鏡下觀察并記錄其孢子形態特征，對病原菌進行形態學鑒定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列擴增及分析

采用基因組DNA快速抽提法提取病原菌基因組DNA[13]， 并進行PCR擴增。PCR采用核糖體內轉錄間隔區（rDNA-ITS）基因擴增通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。擴增反應體系：10×PCR 緩沖液（含Mg.2+）5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L引物ITS1和ITS2各1 μL、模板DNA 2 μL、5 U/mLTaq酶0.5 μL，加ddH2O至總體積50 μL，反應條件為95℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段，由杭州擎科生物有限公司測序，測序結果用BLAST軟件在GenBank上進行同源性比較。

1.5 病原菌室內藥劑篩選

1.5.1 供試藥劑及使用濃度

供試藥劑詳見表1。

1.5.2 平板抑菌試驗方法

分別配制含表1農藥濃度的PDA平板，用直徑為5 mm的打孔器打取病原菌菌落邊緣菌餅，生長菌絲的一面朝下置于各含藥PDA平板中央，以加無菌水的培養基為空白對照，每處理重復3次，置于25℃恒溫培養箱內黑暗培養，于第5天以十字交叉法測量病原菌在含不同藥劑的平板培養基上的菌落直徑，與對照比較計算各藥劑處理對菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

2 結果與分析

2.1 病害田間癥狀

鐵皮石斛種植方式有露天栽培和設施栽培兩大類，設施栽培有盆栽、地栽、床栽（架空苗床種植）等方式，浙江杭州、溫州和金華等鐵皮石斛基地90%以上是使用床栽方式種植的，有兩層遮陰網、冬季還有一至二層薄膜覆蓋，空氣濕度保持80%以上，冬季不落葉，病害在田間可終年發生危害。而露天栽培鐵皮石斛因冬季低溫老葉基本落光，炭疽病發病明顯輕于設施栽培，病菌以菌絲體或分生孢子在鐵皮石斛被害部位或病殘體上越冬，翌年條件適宜時產生分生孢子，通過風雨、農事操作將病原菌傳播至健康葉片上，再產生病斑形成分生孢子不斷重復侵染。調查了杭州、溫州和金華等鐵皮石斛基地發現，炭疽病是各鐵皮石斛基地的主要葉部病害，浙江不同區域發病的嚴重度與癥狀基本相似。調查研究發現：浙江鐵皮石斛炭疽病不僅可以危害當年移植的石斛苗，也危害2～3年生的石斛植株，高溫高濕的梅雨季節和夏、秋高溫季節是病害的高發期，在設施栽培地，株發病率達30%以上，有的成片死亡，在病害發生過的地方，補栽的石斛苗發病率可達50%以上。

該病害在石斛幼苗期（圖1a）和成株期（圖1b～c）都可以發生，病原菌侵染初期，葉片上出現淡黃色至黃褐色圓形或近圓形病斑（圖1b）。病斑一般從近莖基部的老葉上開始出現，逐步向莖上部蔓延擴展。在病害發生后期，病斑呈黑色或黑褐色且略有下陷，直徑可達5 mm（圖1c）。在相對濕度較大時，病斑上會產生灰褐色的分生孢子堆。

2.2 病原菌分離及致病性測定

從浙江杭州、溫州和金華采集的病葉上共分離純化出5株菌株CG1、CG2、CG3、CG4和CG5，菌株CG1、CG2分離自杭州正德農業科技有限公司蕭山鐵皮石斛基地采集的樣本，菌株CG3、CG4分離自金華市義烏鐵皮石斛基地采集的樣本，菌株CG5分離自溫州市樂清鐵皮石斛基地采集的樣本，這5株菌在PDA上的生長速度與菌落形態特征一致。在生長初期，氣生菌絲白色，后逐漸變為青灰色至深灰色，菌絲呈絮狀，短而致密。背面有明顯的同心輪紋。選取CG1作為代表性菌株進行盆栽接種試驗，結果表明：孢子懸浮液噴霧接種5 d后，可見黃色圓形病斑出現，大多數為針尖大小（圖1d）。三周后可在多數接種孢子的處理葉片上看到明顯黑色圓形病斑（圖1e），略有凹陷。以無菌水接種的對照未見病斑。分離并純化受侵染葉片組織的病原物，得到形態學上與CG1相同的病原菌。

2.3 分離菌株的菌落與形態學特征

菌株CG1、CG2、CG3、CG4和CG5在PDA培養基上的菌絲密集，呈絮狀。菌落生長初期為白色，后變為青灰色至深灰色（圖1f），背面中心黑色，外圍灰色，菌落呈同心輪紋狀生長（圖1g），10 d可長滿直徑為9 cm的平板。一個月后，可在菌落的表面及內部形成黑色、凸起的分生孢子堆（圖1h）。顯微鏡下分生孢子長橢圓形（圖1i），菌絲壁光滑（圖1j），分生孢子大小為（9.18～14.11）μm×（4.02～6.64）μm，平均為12.23 μm×4.89 μm。

2.4 病原菌分子生物學特征

鐵皮石斛炭疽病病原菌菌株CG1～CG5的rDNA-ITS序列長度均為580 bp，GenBank登錄號依次為MF939643、MF939644、MF939645、MF939646、MF939647。用BLAST軟件在GenBank中與相近的其他病原菌比對，結果表明，菌株CG1～CG5的rDNA-ITS序列均與GenBank中菌株號為KF053200.1、KY962993.1和KM013432.1的膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具有99%的相似性。通過系統發育樹分析表明，鐵皮石斛炭疽病病原菌與膠孢炭疽菌同源性最高，位于系統發育樹的同一分支，支持率為65%（圖2）。結合鐵皮石斛炭疽病病原菌形態特征，根據rDNA-ITS序列分析結果，將鐵皮石斛炭疽病病原菌確定為膠孢炭疽菌。

2.5 病原菌室內藥劑篩選

由表1可知，在平板藥劑篩選試驗中，抑菌效果最好的是6%春雷霉素可濕性粉劑1 000倍液和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 000倍液，抑菌率均達到了96%以上。然后依次是10%苯醚甲環唑可濕性粉劑1 500倍液、99%惡菌靈原藥3 000倍液、25%吡唑醚菌酯乳油2 000倍液、50%嘧菌環胺水分散粒劑750倍液、29%吡萘嘧菌酯懸浮劑1 500倍液、42.8%氟菌肟菌酯懸浮劑3 500倍液、224%啶氧菌酯懸浮劑1 500倍液、1 000億/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2500倍液。24%噻呋酰胺懸浮劑2 000倍液對膠孢炭疽菌抑制率最差，只有66%。

3 結論與討論

本研究對引起浙江杭州、溫州和金華等鐵皮石斛炭疽病的病原菌進行了分離與鑒定，將分離到的病原菌用柯赫氏法則進行盆栽接種試驗，分離到的菌株所引起的病害癥狀與田間石斛葉部病害癥狀一致，并且從發病的葉片組織上再次分離到該病原菌。經致病性試驗、病原菌形態學特征觀察、rDNA-ITS序列分析，結合田間癥狀觀察，明確引起浙江省鐵皮石斛炭疽病的病原菌是膠孢炭疽菌。張翊等人[14]認為引起貴州赤水金釵石斛炭疽病的病原也為膠孢炭疽菌，但文中對癥狀沒有描述，對病原菌的致病性沒有測定。王曉陽從金釵石斛上分離到引起炭疽病的病原菌為博寧炭疽菌C.boninense.[15]，據作者描述博寧炭疽菌在金釵石斛上引起的病害癥狀類似疫病，病害從莖基部或根部開始發病，后病部軟化并蔓延至其他部位，這個癥狀與我們在田間觀察到的癥狀有很大差異，在浙江杭州、金華和溫州等多家鐵皮石斛基地都未曾觀察到炭疽病從莖基部或根部開始發病，我們觀察到的癥狀主要在葉片上引起葉斑。浙江炭疽病的癥狀與趙桂華等[11]描述的由黑線炭疽菌C.dematium引起的江蘇句容鐵皮石斛炭疽病癥狀、李海明等[12]描述的由辣椒炭疽菌C.capsici引起的福建連城等地的鐵皮石斛炭疽病癥狀以及邱道壽等[3]描述的由C.phalaenopsis引起的珠三角鐵皮石斛炭疽病癥狀均相似。說明石斛炭疽病由不同種炭疽菌引起，從癥狀上難以區別，抗病育種工作者應針對當地主要病原種群進行育種。

本次試驗測定了11種殺菌劑對鐵皮石斛炭疽病病原菌的抑菌效果，結果表明春雷霉素和甲基硫菌靈對病菌的抑制效果較好，苯醚甲環唑、惡菌靈等也有一定的抑制效果，而枯草芽孢桿菌和噻呋酰胺對該病菌基本沒有抑制作用。測定結果為鐵皮石斛炭疽病的田間藥劑試驗提供基礎，由于本試驗是在室內完成，所以在田間病害防控推廣前，還需開展田間藥劑試驗，此外，還應考慮藥劑成本及對鐵皮石斛生長和生態環境的影響，力求施用高效低毒、低殘留和低成本的藥劑。鐵皮石斛是名貴的中藥材，在栽培管理過程中應盡可能減少化肥與農藥的使用，加強生產與科研單位的合作與配合，從病原學和病害流行學入手，研究明確病害發生流行規律，找出關鍵防治時期，開展綠色生態防控研究，保障石斛種植產業健康持續發展。

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（責任編輯：楊明麗）