基于SLAF—seq技術的煙草抗CMV主效QTL定位

潘旭浩 程立銳 陳小翠 蔣彩虹 任民 楊愛國

摘 要：煙草花葉?。–MV）是煙草主要病害之一，篩選與CMV抗病QTL緊密連鎖的分子標記是煙草抗病分子育種的重要部分。本研究以抗病材料臺煙8號和感病材料NC82為親本，獲得BC1群體，構建抗、感池。采用BSA和SLAF-seq技術開發CMV抗病相關SNP分子標記，共獲得180 370個SLAF標簽，經分析后獲得6156個多態性SNP標記。利用SNP-index分析方法，發現兩個與CMV抗病高度關聯的區域。利用這些分子標記成功定位到了兩個CMV抗病相關QTL，其中一個QTL定位于Chr01上的55.72 ～60.44 Mb區間內，區間大小為4.72 Mb；另一個則定位于煙草Chr18上的44.21～48.70 Mb區間內，區間大小為4.49 Mb。在關聯到的QTL區間內設計分子標記可以用于煙草抗CMV育種的輔助選擇。

關鍵詞：煙草；CMV抗性；QTL；SALF-seq

中圖分類號：S572.03 文章編號：1007-5119（2018）05-0001-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.001

Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） is one of most important diseases in tobacco， and selection of molecular markers closely linked to CMV resistant QTLs is a key for tobacco CMV-resistance breeding. In order to identify genes closely linked to CMV resistance and develop resistant varieties， a BC1 population derived from resistant-parent Taiyan-8 and susceptible-parent NC82 was used to construct resistant and susceptible pools. By application of BSA and SLAF-seq technique， a total of 180，370 SALF labels were obtained and 6，156 polymorphic SNP markers were developed. As a result， two CMV-associated regions were identified by analysis of SNP-index data. Our results showed that abundant polymorphic SNPs can be developed between tobacco varieties using SALF-seq. By utilization of these SNPs， two CMV-resistance QTLs were successfully identified in Chr01 and Chr18， with 4.72 Mb and 4.49 Mb interval， respectively. The two identified QTLs are useful for in molecular marker assisted selection in tobacco breeding programs for CMV resistance.

Keywords： tobacco； CMV resistance； QTL； SLAF-seq

黃瓜花葉病毒?。–ucumber mosaic virus，CMV）是一種病毒性病害，在煙草中主要經由蚜蟲或汁液摩擦進行傳播，感病后主要表現為煙葉花斑、葉片卷曲，嚴重時直接影響煙株發育，導致煙葉產量、質量下降。其流行速度快，發生范圍廣，是我國發生最為普遍、危害最大的煙草病害之一。目前生產上對煙草CMV防治主要還是以化學防治為主，不僅浪費人力，增加種植成本，而且對于環境也會造成不利的影響，因此，培育CMV抗病品種一直被認為是防治CMV的有效手段。但是由于煙草CMV抗性由多基因控制[1]，高抗病的種質資源缺乏，通過常規育種手段選育抗病品種的耗時長，效果差。

因此開發與抗病基因緊密連鎖的分子標記，通過分子標記輔助育種可以加快培育煙草抗CMV品種的進程，提高育種效率。

前人關于CMV抗病的研究多集中在辣椒[2-3]、黃瓜[4-5]等作物上。由于煙草遺傳背景狹窄[6]，可利用的傳統分子標記數量少，多態性差，關于煙草CMV抗病QTL（Quantitative trait loci，數量性狀基因座）的研究較為滯后。目前，僅有少量與煙草CMV抗病QTL相關的文獻發表，范靜苑等[7]構建了煙草BC1群體，并基于混合群體分組分析法（BSA）對CMV抗病基因進行了初步定位，獲得了兩個和CMV抗性基因連鎖的標記SM1350和SM2270；文柯等[1]在煙草上對BC1群體進行QTL基因定位，找到了一個與抗性QTL緊密連鎖的標記53 735，遺傳距離為0.1 cM，該QTL位于10號連鎖群，貢獻率為13%。

目前發表的煙草抗CMV分子標記無論從數量還是準確性上，離實際應用分子標記進行輔助育種仍有很大距離。簡化基因組測序（Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）技術是以生物信息學為基礎的高度自動化高通量測序技術[8]，其具有可重復性高，測序時間短，獲取信息量大，可利用多態性SNP標記多等重要特點，可以有效克服煙草遺傳背景狹窄，傳統多態性標記缺乏的缺點，利用該技術有望對煙草CMV抗病基因進行精細定位。

本研究在前人研究基礎上，基于390個BC1單株接種CMV后鑒定結果，構建抗病池和感病池，利用SLAF-seq開發大量SNP多態性標記，獲得CMV主效QTL位點，定位了這些位點在煙草染色體上的位置，為煙草抗CMV分子標記開發以及抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試親本及群體：抗病親本為臺煙8號（P1），感病親本為NC82（P2），兩個親本雜交后F1代與臺煙8號回交，獲得包含390個單株BC1群體作為供試群體。

供試材料無性擴繁：利用P1、P2、F1、BC1群體材料單株的葉片進行組織擴繁、無性繁殖，每個單株均獲得與之基因組完全一樣的家系材料，這些家系材料用于接種CMV，調查病情，家系的病情即代表擴繁前的單株病情。

毒源：用于接種鑒定煙草CMV的毒源為中國農業科學院煙草研究所病蟲害綜合防治中心提供的CMV-C（普通株系），在使用前15 d進行復壯以防止保存期病毒致病性發生變異。

1.2 群體接種、病情指數鑒定及群體病級方差分析

對供試BC1群體CMV抗性鑒定在中國農業科學院煙草研究所青島即墨基地溫室進行。取經過復壯的攜帶CMV病毒的枯斑三生煙葉于研缽，加少許石英砂和磷酸緩沖液，研磨充分，雙層紗布過濾，然后按終體積比1：5加入磷酸緩沖液定容。在煙苗真葉期時，選擇充分展開的第4～5片真葉，在葉面上均勻撒400～500目的石英砂，用脫脂棉球蘸取病毒水溶液輕輕摩擦1～2遍進行接種，盡量保證每片葉接種力度、深度的一致性，接種后立即用水沖洗葉面。在第1次接種5 d后進行第2次摩擦接種，兩次接種力度保持一致。

分別在第2次接種后14～20 d以及20～27 d進行CMV病害調查，并計算病情指數。依據煙草病蟲害分級及調查方法GB/T 23222—2008進行，病毒病分級標準，以株為單位，分0級，1級，3級，5級，7級，9級共六個級別，分別為：

0級：全株無病。

1級：心葉明脈或輕微花葉，病株無明顯矮化。

3級：1/3葉片花葉但不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上。

5級：1/3至1/2葉片花葉，或少數葉片變性，或主脈壞死，植株矮化為正常株高的2/3至3/4。

7級：1/2至2/3葉片花葉，或變形，或主側脈壞死，或植株矮化為正常株高的1/2到2/3。

9級：全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常株高的1/2以上。

病情指數=100×∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）。群體抗性分類標準：免疫（病情指數等于0，無侵染）；高抗（0<病情指數≤15）；中抗（15<病情指數≤30）；中感（30<病情指數≤50）；高感（50<病情指數≤100）[9]。

利用SPSS軟件對BC1群體病級進行單因素ANOVA分析，以確定群體內單株抗病性差異是否顯著。

1.3 群體DNA提取及抗感基因池構建

對所有材料臺煙8號、NC82、F1及BC1群體用植物基因組DNA提取試劑盒進行單株提取，為了保證提取的濃度和純度，本法略微有所改進：根據人工CMV接種及鑒定的結果，從BC1分離群體中選取極端抗病株與極端感病株各52個建立抗感基因池，每個家系樣品根據所測的DNA原始濃度進行等質量混樣，保證所加入的DNA樣品總量相等，抗池標為R-bulk，感病標為S-bulk。

1.4 基于SLAF-seq技術的QTL定位

根據酶切預測軟件（SLAF_Predict）進行煙草基因組酶切預測，本研究采用SspI和HaeIII進行酶切消化；37 ℃酶切15 h，反應結束后用QIAGEN試劑盒純化，50 ?L EB 回溶；在20 ℃反應體系下，加入總體系為100 ?L的酶切DNA片段、ddH2O、dNTPs mix、T4 DNA polymerase、Klenow DNA polymerase、T4 PNK，反應30 min進行5'末端磷酸化修飾；隨后在20 ℃反應條件下，加入Klenow 片段和dATP，在酶切片段的3'端加上單核苷酸A，利用T4連接酶將Duplex測序接頭連接在3'端加單核苷酸A的酶切片段上，反應結束后QIAGEN試劑盒純化，10 ?L EB回溶；在20 ℃反應條件下，將上一步純化產物同時加入DNA ligase buffer 2X、Adapter oligo mix以及DNA ligase反應15 min，反應結束后用QIAGEN試劑盒純化，30 ?L EB回溶；上一步純化的產物用2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，電壓為120 V； 切取464～494 bp目的片段利用QIAGEN試劑盒純化后將產物稀釋，利用Illumina high-throughput sequencing platform（Illumina， Inc； San Diego， CA， U S）進行雙端測序。通過評估Control日本晴測序數據監控實驗過程是否正常，并對序列的reads雙端比對效率、酶切效率、CG含量以及Q20進行分析，評估測序質量。

基因組經酶切處理打斷為無數小片段，每個片段相當于一個標記位點，同一位點reads序列通過相似性聚類，形成一個group。一個group中一般存在1～4條高深度片段，其余全為低深度片段。對測序得到的各樣品的reads數據進行評估，通過相似性聚類、基因型糾錯后，再定位到基因組上，得到SLAF標簽，對SLAF標簽進行多態性分析，得到樣品間的多態性SNP標記。根據得到的多態性標記以及抗池、感池的CMV表型鑒定結果進行關聯分析，將CMV主效QTL位點定位在煙草染色體上。

2 結 果

2.1 供試群體無性繁殖

經過無性繁殖培養得到無菌苗臺煙8號40棵、NC82 40棵、F1 40棵以及BC1群體800棵。在無性擴繁過程中，排除掉家系內新苗大小不一致，或因污染、分化數不夠等情況，共篩選出煙苗長勢一致，家系內植株數5株以上的BC1家系452個，共7362個單株，平均每個BC1家系16株。

2.2 BC1無性繁殖家系CMV抗病鑒定與遺傳分析

在植株5～6葉期時進行兩次幼苗摩擦接毒，在接種后第20～25天進行抗病鑒定，結果發現（圖1）：抗性親本臺煙8號，接種CMV后無明顯感病癥狀；感病親本NC82在完全感病后表現為葉面花葉、皰斑嚴重，葉片畸形呈柳條狀、鐮刀狀，葉緣底部橢圓而葉尖細長，植株矮化、纖弱；F1大部分表現出花葉、畸形等感病癥狀（圖1）。BC1群體材料則表現出分離，部分植株表現為抗病，部分植株表現為感病，而多數植株發病表現介于兩個親本之間（圖2）。為減小CMV抗病鑒定中的人為、環境誤差，BC1群體每個單株均構建了無性繁殖家系，通過群體單株家系的平均抗、感病表現，計算群體單株的病情指數，最終對390個BC1群體家系進行了鑒定分析，結果表明，臺煙8號病情指數介于10～15之間；NC82病情指數在30～50。BC1群體中，約78個家系病情指數小于15，鑒定為抗病，206個家系病情指數在15～30，鑒定為中抗，約106個家系病情指數大于30，鑒定為感病。BC1群體CMV抗病性狀整體呈現連續分布，因此說明抗病親本的CMV抗性由多基因控制，為數量遺傳性狀（圖2）。BC1群體病級方差分析結果表明（表1），群體內單株間病級指數存在極顯著差異。

2.3 BC1群體抗、感池構建

根據BC1群體獲得CMV病情指數進行抗、感

池構建：選取的原則是單株家系數量大于等于5，且抗池病情指數小于15，感池病情指數大于33.33。根據單株DNA的檢測濃度進行等質量混樣，混樣數為抗、感池各52個樣品。經檢測P1、P2、R-bulk和S-bulk 的濃度均大于50 ng/?L，OD260/280在1.8～2.0之間，OD260/230大于2.0，表現單峰，無色素和蛋白質污染，檢測結果合格。瓊脂糖電泳檢測DNA完整性高（圖3）。

2.4 酶切效率統計與建庫評估

序列的reads雙端比對結果顯示，Control日本晴水稻在本次實驗雙端比對效率為74.94%，比對效率正常；Control數據的酶切效率E-ratio為96.54%，酶切反應良好[10]；根據酶切體系，通過Control評估所有測序reads的插入片段，繪制所有reads的插入片段分布圖，并估測實際的切膠范圍，本實驗Control測序數據的插入片段大部分都分布在450～550 bp，插入片段的中心值為482 bp（圖4）。綜上所述，文庫構建正常。

2.5 測序數據統計與評估

對已構建的BC1群體抗、感池以及兩個親本進行SLAF-seq全基因組測序，采用Q20檢測和堿基分布檢查的方法對測序結果進行評估和過濾以保證后期的分析質量。測序結果顯示，試驗總共得到54.4 Mb測序reads，總數據量為8.7 Gb；其中臺煙8號作為抗性親本有效reads 13 854 896個，NC82作為感性親本有效reads為9 139 744個，感池S-bulk有效reads為16 321 266個，抗池R-bulk有效reads為15 023 916個。試驗的堿基質量主要集中在20～40之間，即測序錯誤率在0.01%～1%，能夠保證后面的多態性分析和關聯分析。測序獲得平均GC 含量為32.93%（表2），GC含量均較低，說明達到測序要求。

2.6 SNP標記開發及抗CMV主效QTL位點定位

本試驗獲得有效SLAF標簽數為180 370個。對得到的180 370個SLAF標簽，根據等位基因數和基因序列之間的差異進行多態性分析，共得到SNP、INDEL、No Polymorphism和Repeat 4種SLAF標簽，其中SNP和INDEL統稱為多態性標記。本次分析共得到6156個多態性標記且均為SNP標記，多態性比例為3.41%（表3）。

SNP-index方法計算關聯值，并采用SNPNUM方法對△SNP-index 進行擬合，取每個SNP附近200個SNP 的△SNP-index的中值作為該位點擬合后的關聯值。根據計算機模擬實驗計算[11]結果，發現與CMV抗性性狀關聯的SNP標記主要集中在兩個區間之內：其中一個QTL定位于煙草Chr01上的55.72～60.44 Mb區間內，區間大小為4.72 Mb；另一個則定位于煙草Chr18上的44.21～48.70 Mb區間內，區間大小為4.49 Mb。

利用茄科基因組數據庫（https：//solgenomics. net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）對兩個區間進行基因預測。在Chr01的4.72 Mb區間內有34個基因，其中有20個基因功能已被注釋；在Chr18的4.49 Mb區間內有41個基因，其中有31個基因功能已被注釋。經初步分析，兩個區間內均存在鋅指蛋白家族基因，該基因家族成員可能與煙草CMV抗性相關。

3 討 論

分子標記輔助育種技術可以大大提高作物育種效率[12]。在早期的研究中，SSR標記因其穩定、可靠、易操作的特點，成為在連鎖作圖、QTL定位中應用最為廣泛的標記[13]。但是，由于煙草本身遺傳背景狹窄，標記多態性差，使得SSR標記在煙草抗病基因QTL定位研究中利用難度大、效率低、效果差。目前，SLAF-seq技術在單體型圖譜繪制、遺傳圖譜繪制、關聯性圖譜繪制和多態性圖譜繪制等方面的應用已有大量成功案例，利用SLAF技術和BSA進行SNP開發及QTL定位的研究已在擬南芥[14]、黃瓜[15]、甘藍型油菜[16]等不同植物上有相關報道。利用SLAF技術可以在短時間內獲得遍布整個基因組的海量多態性SNP標記，從而實現對目標QTL的精細定位。

本研究結合BSA方法，構建了BC1群體以及其群體單株無性繁殖家系，通過對BC1群體單株家系CMV抗病性的鑒定獲得了較為準確的抗病表型數據，并構建抗、感病極端混池。利用SLAF-seq技術獲得了覆蓋全基因組SLAF標簽數為180 370個，經篩選其中多態性SNP標記共6156個，多態性比率為3.41%。

與SSR標記進行比較，牟建英[17]以白粉病抗感材料為親本篩選了2317對SSR引物，得到61對多態性標記，多態性比率僅為2.6%；高亭亭等[18]利用2653個SSR標記對煙草黑脛病抗感親本進行全基因組篩選，共得到184對多態性引物，多態比率為6.9%；WU等[19]利用1376對SSR引物對白稈突變體及HD之間進行全基因組篩選，最終僅獲得96個在全基因組均勻分布的SSR多態性標記，多態比率為6.9%；而目前密度最大的烤煙SSR標記遺傳連鎖圖僅含覆蓋24個連鎖群的611個SSR標記[20]。從多態性比率來看，本研究中SNP標記多態性比率與SSR標記差別不大，這進一步驗證了煙草遺傳背景狹窄、標記多態性差的結論。但是由于開發的SNP標記基數大，覆蓋密度高，與前人研究進行對比，本研究中通過SLAF-seq技術獲得的煙草多態性SNP標記數量是常規SSR標記的幾十倍甚至上百倍，有效地克服了SSR標記在煙草研究上的缺點，為煙草CMV抗病QTL定位提供了有力的技術保證。

一般來說，在構建連鎖圖譜進行基因定位的研究中，標記覆蓋的連鎖群越全，連鎖群上標記密度越大，定位效果越好，反之則定位QTL可靠性、可用性就會降低。在煙草CMV抗病QTL研究中，文柯[1]利用SSR標記對煙草CMV抗性進行定位，在該研究中63個標記僅覆蓋了11個連鎖群，其中標記最多的連鎖群僅有8個標記，而有5個連鎖群僅由2個標記構成；在煙草其他病害QTL定位中，TONG等[21]利用2000多對SSR標記對煙草赤星病進行定位，從中篩選出了覆蓋24個連鎖群的181個多態性標記，平均每個連鎖群標記數為7.54個；LAN等[22]在對煙草青枯病的研究中，利用201個SSR標記構建了24個鎖鏈群，平均每個連鎖群標記數8.37個。而在本研究中，利用分布于全部24個連鎖群的6156個SNP多態性用于CMV抗病QTL定位，平均每條染色體多態性標記達到256.5個。

從CMV抗病QTL定位結果來看，文柯利用SSR標記找到了一個與CMV抗病相關的QTL并將其定位在10號連鎖群上，10號連鎖群僅含有2個SSR標記53 735和54 169，標記之間間距為13.41 cM；在本研究中，我們發現了兩個CMV抗病QTL，其中一個QTL被定位于Chr01染色體的4.72 Mb區間內，另一個被定位于Chr18染色體的4.49 Mb區間內。本研究相較前人研究定位了兩個抗CMV主效QTL，這也與煙草CMV受多基因控制的結論更吻合，同時這兩個QTL定位區間也更小，為進一步基因精細定位與克隆打好了基礎。本研究結果充分說明在煙草上利用SLAF-seq技術開發SNP標記進行基因定位比SSR標記更為可靠、高效。

本研究進一步對Chr01和Chr18染色體上定位QTL區間內包含的基因進行分析，發現在Chr01的4.72 Mb區間內共有34個基因，發現其中有14個基因功能未知，其余20個基因功能已被注釋；在Chr18的4.49 Mb區間內共有41個基因，其中有10個基因功能未知，另外31個基因功能已被注釋。對已注釋基因的功能進行分析發現，在兩個區間內均發現鋅指蛋白（Zinc finger）家族基因，其中在Chr01區間內的有兩個鋅指蛋白家族基因，它們分別為C3HC4類型和C2C2類型；而在Chr18區間內也有兩個鋅指蛋白基因，均為C2H2類型。鋅指蛋白是一個龐大的轉錄因子家族，其功能主要是調控基因表達[23]，根據鋅指蛋白保守基序特點，可以將其分成9大類，而C2H2、C3HC4、C2C2便是其中主要的3種類型[24]。前人關于鋅指蛋白的研究主要集中在植物發育和非生物脅迫上，而抗病方面的研究目前還處于起步階段，但是根據前人有限的報道，這3種類型的鋅指蛋白均有家族成員與植物抗病功能相關。其中，C2H2和C3HC4家族基因中已有其與CMV抗性相關的報道，如煙草ZFT1基因在感染煙草花葉病毒后也會受到不同程度地誘導，激起敏感應答[25]；而擬南芥STZ基因感染黃瓜花葉病毒，同樣誘導過敏反應[26]；水稻鋅指蛋白基因OsBIRF1過表達載體轉入煙草后，轉基因煙草增強了對煙草花葉病毒、野火病菌和煙粉虱的抗性，防御相關基因的表達水平也升高了[27]；除此之外C2C2類型基因如OsLOL2有報道稱過表達該基因可提高水稻對稻瘟病的抗病性[28]。因此，本研究初步預測上述4個鋅指蛋白基因可能就是參與煙草CMV抗病調控的候選基因。在本研究基礎上，進一步開展抗病基因克隆及基因功能驗證并開發分子標記，對于闡明煙草與CMV病毒間的互作機制和CMV抗病分子標記輔助育種具有重要意義。

4 結 論

利用SLAF-seq技術對CMV抗、感親本及后代群體進行簡化測序，開發了覆蓋24個連鎖群的6156個多態性標記，對BC1 群體抗病表型及基因型進行連鎖分析，找到了兩個與CMV抗性緊密連鎖的QTL，分別定位于染色體Chr01的4.72 Mb以及Chr18的4.49 Mb區間內，本研究獲得的兩個抗病QTL為煙草CMV抗病分子育種提供了重要的理論依據。

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