土壤有機質含量和酸堿度對煙草內生真菌生物多樣性的影響

李盼盼 李方明 申國明 高林 余軍 鄭璇 張鵬

摘要：為研究環境生態因素對煙草內生真菌的影響，在湖北省恩施州選取不同有機質含量和酸堿度的田塊，以云煙87為供試植株，探究土壤有機質含量和酸堿度對煙草內生真菌生物多樣性的影響。試驗分別選取6塊不同有機質含量（分別為16.3，20.7，233，27.1，31.4和35.6 g/kg及4塊不同pH（分別為4.3，5.5，6.4和7.6）的田塊，采用五點取樣法采集健康煙草植株，分離純化根中內生真菌并根據rDNA-ITS序列分析進行菌種鑒定，以Shannon多樣性指數及相對分離頻率反映內生真菌生物多樣性。結果發現，煙草內生真菌生物多樣性隨土壤有機質含量的升高呈先上升后下降的趨勢，在6個不同土壤有機質含量下，內生真菌shannon多樣性指數分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59：而煙草內生真菌生物多樣性隨土壤pH的升高呈下降的趨勢，在4個不同土壤pH下，內生真菌Shannon多樣性指數分別為1.36、1.12、0.93和0.83。研究表明，土壤有機質含量和酸堿度會對煙草內生真菌生物多樣性產生一定影響。在一定范圍內，土壤有機質含量的升高或者pH的降低可以增加煙草內生真菌的物種豐富度。

關鍵詞：土壤；有機質：酸堿度：煙草內生真菌；生物多樣性

煙草內生真菌（Tobacco endophytic fungi）是定殖于煙草組織內部，不會引起煙草產生明顯病害或者不良影響的一類真菌。煙草內生真菌具有豐富的生物多樣性，其在與宿主植物煙草的協同進化過程中建立了互利共生關系，對煙草的生長、固氮、抗病害等發揮著重要作用。植物內生真菌的來源途徑之一是根際微生物通過植物側根的裂縫進入植物體內。土壤是根生長發育的必要環境，而其理化性質特別是有機質含量和酸堿度對根際土壤中微生物的生物活性及多樣性有重要影響。焦曉光等發現土壤有機質含量最高的農田黑土微生物群落的豐度、多樣性和均勻性指數最高。在外界環境一致的條件下，農田黑土有機質含量不同可影響土壤微生物群落的代謝能力。米亮通過對4個不同有機質含量的黑土微生物群落結構和代謝功能多樣性進行比較，從而解析了有機質含量對黑土微生物群落結構和代謝功能及作物根際微生物群落結構的影響。孫冰潔等綜述了農田土壤物理性質（密度、孔隙、水分、溫度）及化學性質（土壤pH、土壤有機質）對土壤微生物群落的影響。由上推測，土壤的理化性質及生態環境因子會通過影響煙草根際土壤微生物從而對煙草內生真菌的多樣性及分布產生一定影響，但目前還沒有關于土壤有機質含量和酸堿度對煙草內生真菌生物多樣性影響的相關報道。

生物多樣性的研究對于認識生物群體的結構及功能、行為和生活史，以及他們與人類生存環境的關系，科學有效地開發利用生物資源具有十分重要的意義。煙草內生真菌是煙田微生物生態系統重要的一個類群，開展煙草內生真菌種群多樣性的研究不僅可以在群體水平上揭示其空間、地理區域分布的動態變化規律，構建煙草內生真菌研究的基礎理論與基本方法，也為以后更深入的研究與資源開發利用奠定基礎。

恩施州位于湖北省西南部，氣候、土壤條件優良，煙草種植歷史悠久。研究表明，恩施州土壤養分含量分布極不均衡，各植煙點間的養分含量差異較大：土壤有機質的范圍為2.8-43.8 g/kg，土壤pH值范圍為4.1-7.9。本研究利用湖北恩施土壤有機質含量、酸堿度范圍廣的特點，探究土壤有機質含量和酸堿度對煙草內生真菌生物多樣性影響，以期找到土壤有機質含量、酸堿度和煙草內生真菌多樣性之間的關系，為系統構建土壤理化性質一煙草內生真菌多樣性研究體系奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗田塊選擇及樣品采集

在參考已有試驗研究的基礎上，于湖北恩施州望城坡和城郊煙站，測定并選擇6塊土壤有機質含量分別為16.3，20.7，23.3，27.1，31.4和35.6g/kg，但其他理化性質差異不顯著的田塊：選擇4塊土壤pH分別為4.3，5.5，6.4和7.6，但其他理化性質差異不顯著的田塊進行煙株根系樣品的采集。于2017年5-8月，采用五點取樣法采集健康煙株的根部（主根，地下約5cm處），然后帶回實驗室4℃保存，并在24h內處理完畢。

1.2煙草內生真菌的分離

將采集的根部樣品在自來水下充分沖洗，除去表面的泥土。表面滅菌采取如下步驟：75%乙醇消毒1 min：2.5%次氯酸鈉消毒30 s：75%乙醇消毒1min：然后用無菌水漂洗3遍。將滅菌的根部組織切塊，將切口插入PDA培養基上，28℃培養3～7d。待培養基中切口處有菌絲長出，挑取菌絲至新的PDA培養基上，劃線稀釋分離，直至獲得純培養。試驗設置未經表面滅菌的組織作為對照，并通過漂洗液檢驗法和組織印跡法來檢驗表面滅菌效果。

1.3內生真菌的分類鑒定

采用CTAB法提取分離的內生真菌基因組DNA。利用通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增。擴增成功的PCR產物純化后經上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。通過BLAST序列比對，最終確定菌株的分類地位。

1.4數據分析

以香農多樣性指數（shannon's diversity index，H）來反映煙草內生真菌的生物多樣性，用相對分離頻率衡量某種內生真菌的優勢度，用Sorenson相似性系數Cs來分析煙草內生真菌菌群組成的相似程度。其公式分別為：

其中，K為煙草內生真菌種類的總數，P為某種煙草內生真菌的菌株數占全部內生真菌菌株數的百分數。

相對分離頻率（%）=某種內生真菌的菌株數/全部內生真菌總菌株數

（2）

其中，相對分離頻率（RF）≥10%的內生真菌為優勢菌，RF≥1%的內生真菌為常見菌，RF<1%的為稀有菌。

其中，為兩個土壤有機質含量或pH值下煙草樣品中共有的內生真菌屬數，a為某一土壤有機質含量或pH值下煙草樣品中內生真菌屬數，b為另一土壤酸堿度或pH下煙草樣品中內生真菌屬數。

2結果

2.1不同土壤有機質含量下煙草內生真菌的多樣性

在6個土壤有機質含量下采集的健康煙株根系中共分離到278株內生真菌（表1），鑒定為34屬，Shannon多樣性指數為4.56。6個有機質含量下分別分離到15、19、22、28、23和18屬，Shannon多樣性指數分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59。根據菌株的相對分離頻率，優勢菌群為曲霉屬Aspergillus，其相對分離頻率為1 8.35%。常見菌群為23屬，分別為刺盤孢屬Colletotrichum、莖點霉屬Phoma、鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、彎孢屬Curvularia、附球菌屬Epicoccum、鐮孢屬Fusarium、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、踝節菌屬Talaromyces、黑孢屬Nigrospora、蔓枯病屬、球座菌屬Guignardia、木霉屬、毛殼屬、小叢殼屬、白粉寄生孢、毛霉屬、棒孢屬、端梗孢屬Acrophialophora、新薩托屬Neosartorya、葉點霉屬Phyllosticta、梭孢殼屬Thielavia和枝孢屬Cladosporium。稀有菌群為10屬，分別為派倫霉屬Peyronellaea、角擔菌屬Ceratobasidium、松球殼孢菌、雙極霉屬Bipolaris、耐堿酵母屬Galactomyces、炭角菌屬Xylariaceae、擬青霉屬Paecilomyces、并頭狀菌屬Syncephalastrum、旋孢腔屬CochBobolus、被孢霉屬Mortierella。其中，耐堿酵母屬和并頭狀菌屬只在有機質含量為27.1 g/kg的根系中分離到，旋孢腔屬和被孢霉屬只在有機質含量為31.4g/kg的根系中分離到，派倫霉屬、松球殼孢菌、炭角菌屬、角擔菌屬分別只在有機質含量為16.3、20.7、23.3、35.6 g/kg的根系中分離到。由此可見，煙草內生真菌的多樣性隨著土壤有機質含量的升高呈現先上升后下降的趨勢，并且部分菌株只在特定的土壤有機質含量下被分離到，表現出專化性。

2.2不同土壤酸堿度下煙草內生真菌的多樣性

在4個土壤pH值下采集的健康煙株根系中共分離到內生真菌215株，鑒定為32屬，Shannon多樣性指數為4.23。土壤pH值4.4、5.5、6.4、7.6下分別分離到29、25、22和18屬，Shannon多樣性指數分別為1.36、1.12、0.93和0.83。根據菌株的相對分離頻率，曲霉屬Aspergillus為優勢菌群，其相對分離頻率為16.74%。常見菌群為20屬，分別為刺盤孢屬Colletotrichum、莖點霉屬Phoma、鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、彎孢屬Curvularia、附球菌屬Epicoccum、鐮孢屬Fusarium、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、踝節菌屬Talaromyces、黑孢屬Nigrospora、蔓枯病屬Didymella、球座菌屬Guignardia、木霉屬Trichoderma、小叢殼屬Glomerella、雙極霉屬Bipolaris、毛霉屬Rhizomucor.擬青霉屬Paecilomyces、新薩托屬Neosartorya、葉點霉屬Phyllosticta、梭孢殼屬Thielavia。稀有菌群為11屬，分別為毛殼屬Chaetomium、派倫霉屬Peyronellaea、小光殼屬Leptosphaerulina、半內果菌屬Hamigera、白粉寄生孢Ampelomyces、松球殼孢菌、棒孢屬Corynespora、端梗孢屬Acrophialophora、Setophoma（尚未中文命名）、并頭狀菌屬、枝孢屬Cladosporium（圖1）。其中，半內果菌屬、Setophoma只在土壤pH為4.4的煙株根系中分離到，端梗孢屬、枝孢屬、派倫霉屬分別只在土壤pH為5.5、6.4、7.6的煙株根系中分離到。由此可見，煙草內生真菌的多樣性隨著土壤pH值的升高呈現下降的趨勢，并且部分菌株同樣表現出專化性。

2.3不同土壤有機質含量和酸堿度下煙草內生真菌菌群組成的相似性

由表2可見，不同土壤有機質含量下煙草內生真菌組成的相似性系數介于0.61～0.84，含量16.3g/kg的菌群組成與35.6 eCkg的菌群組成相似性系數最低，為0.61：而有機質含量為23.3 g/kg的菌群組成與27.1 g&g的相似性系數最高，為0.84。不同土壤pH下（表3）煙草內生真菌組成的相似性系數介于0.70～0.89，土壤pH5.5和6.4時的菌群組成與7.6時的菌群組成相似性系數均為0.70，而土壤pH 4.4時的菌群組成與5.5時的菌群組成相似性系數最高，為0.89。總體而言，不同有機質含量和酸堿度下煙草內生真菌的菌群組成相似性較高。

3討論

本研究選擇6個不同有機質含量和4個不同酸堿度的田塊采集健康煙株的根系組織，進行內生真菌的分離、純化和鑒定。Shannon多樣性指數表明，煙草內生真菌的多樣性隨著土壤有機質含量的升高呈現先上升后下降的趨勢，而隨著土壤pH的升高呈現下降的趨勢。植物內生真菌的來源途徑之一是根際微生物，土壤環境會對根際真菌的定殖產生重要影響，因此土壤環境也會對根中的內生真菌產生一定的間接影響。周奇研究發現，根際真菌豐富度和多樣性指數均與土壤有機質含量呈顯著正相關。隨著土壤有機質含量的升高，根際真菌的菌群多樣性逐步增加。但在本試驗選取的土壤有機質含量范圍內，煙草內生真菌的物種多樣性沒有隨著土壤有機質含量的上升呈現上升的趨勢，而是呈先上升后下降的趨勢，原因可能是適宜煙株生長的土壤有機質含量為20 g/kg左右，有機質含量過高違背煙草的需肥規律，不利于煙株的生長發育。當土壤有機質含量超過30 g/kg，煙株根系生長發育不良，不利于根際微生物的進入。研究顯示，土壤pH可以改變土壤微生物群落的結構，真菌數量與土壤pH呈負相關性。本試驗中，隨著土壤pH的升高，煙草內生真菌的多樣性呈現下降的趨勢。由此可見，土壤堿度升高會降低煙草內生真菌的多樣性。

在土壤不同的有機質含量和酸堿度下，煙草內生真菌的優勢菌群均為曲霉屬Aspergillus，可能是由于土壤中曲霉屬真菌受土壤有機質含量和酸堿度變化的影響較小，且在所有根際真菌中處于主導地位：也可能是與其他根際真菌相比，曲霉屬真菌對煙草根系的侵染能力較強。并且，本試驗發現煙草內生真菌表現出土壤理化性質專化性，即在某一特定的土壤有機質含量和酸堿度下，均有特定屬出現。已有研究發現，煙草內生真菌具有組織專化性，可能是由根、莖、葉的生態位不同造成的。內生真菌的土壤理化性質專化性，可能是因為有機質含量和酸堿度的變化導致根際真菌的群落結構發生變化，某些真菌只有在特定的土壤有機質含量和酸堿度條件下才能生存和侵染根系。

4結論

在6個土壤有機質含量下共分離到278株內生真菌，鑒定為34屬。6個有機質含量分別分離到15、19、22、28、23和18屬，Shannon多樣性指數分別為0.53、0.67、0.82、1.09、0.86、0.59。內生真菌多樣性隨著土壤有機質含量的升高呈先上升后下降的趨勢。在4個土壤pH值下共分離到內生真菌215株，鑒定為32屬。土壤pH為4.4、5.5、6.4、7.6下分別分離到29、25、22和18屬，Shannon多樣性指數分別為1.36、1.12、0.93、0.83。內生真菌多樣性隨著土壤pH的升高呈現下降的趨勢。煙草內生真菌表現出土壤理化性質專化性。以上研究表明，煙草內生真菌的多樣性在一定程度上受環境生態因素的影響，而其他環境生態因素，如海拔高度、氣候條件等對煙草內生真菌多樣性的影響同樣值得進一步探究。