合歡樹內生細菌HHY—3的生防作用研究

趙秀芳

[摘 要]本試驗通過對分離自合歡樹葉片中的一株內生細菌HHY-3的生防作用進行了初步研究。通過對峙培養測定了該細菌對5種病原真菌的抑制作用；利用其發酵液進行了合歡枯萎病的防治。結果顯示：該菌對蘋果樹腐爛病菌、梨黑星病菌、合歡枯萎病菌有較好的抑制作用，抑制率分別為75.2%、70.3%和68.5%，而對銀杏褐斑病菌、珍珠梅葉枯病菌的抑制率只為43.8%和35.6%。3種不同接種方法對合歡枯萎病的防治效果不同，其中同時接種防治效果最好為70.1%。

[關鍵詞]合歡樹；內生細菌；抑制作用；防效

[中圖分類號]S641.2 [文獻標識碼]A

銀合歡（ Albizzia julibrissin ） 又稱絨花樹等，屬豆科類植物，在我國華北地區、黃河流域及華南各地均有廣泛種植，另外在朝鮮、越南、印度、日本等亞洲地區也有分布，且合歡品種資源非常豐富。合歡不僅在綠化園林中運用廣泛，作為行道樹美化環境；而且它在原材料和中醫藥中也有很高的經濟價值。目前，人們在對合歡防治病害的研究中主要是對其組織內的有機化合物的分離、純化和鑒定。Han等對合歡汁液進行提取和初步鑒定，發現它含有20余種化合物，包括甾醇、苷黃酮類化合物、有機酸、神經酰胺及苷等多種活性物質，在中藥藥理中具有抗過敏、抗氧化、抗癌、抗炎、殺菌、增加免疫力等多種作用。如合歡葉組織的提取物可以很好地預防黃瓜霜霉病（Pseudoperonospora cubensis）；合歡粗提物對根結線蟲（Meloidogyne spp）有較強的抑制作用；此外還可以防治油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；合歡莖葉含有的有效物質對腐爛病菌（Valsa mali）、炭疽病菌（Colletotrichum capsici）均有一定程度的抑制作用效果，說明合歡組織里存在許多抑菌活性物質，而且抑菌譜較廣。而關于從合歡組織中分離內生菌進行病害防治的研究鮮為報道。

目前已經證實內生細菌廣泛存在于健康植物體內，可以提高植物抗逆能力，改善系統生態平衡；具有多種特性，使之成為植物微生態系統中的重要組成部分；同時內生細菌還是良好的外源基因載體，為抗病、殺蟲和固氮等外源基因導入植物體內提供了新的途徑和方法。當前植物內生菌的研究在深度及廣度上都有很大進展，對于植物內生菌植物資源的研究更是寬泛，從作物、果蔬到中草藥、野生植物等。說明我國植物資源分布廣泛，植物內生菌資源種類豐富。本試驗根據合歡的藥用性及較強的環境適應性和抗病能力，以內生細菌的研究技術為基礎，對合歡的內生細菌進行生防研究，以期為園林及藥用植物內生細菌開發利用、生防機制的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

合歡樹內生細菌HHY-3，分離于山西農業大學校園里的合歡樹葉片，4℃保存，菌體存放在50%的甘油中可于-20℃長期保存。

蘋果腐爛病菌（Valsa mali ）、梨黑星病菌（Venturia piritna）、合歡枯萎病菌（Fusarium oxysporwm schl.f.sp.perndiosium）、珍珠梅褐斑病菌（ Sorbaria sorbifolia）、銀杏葉枯病菌（Alternaria alternata）以上菌株均由山西農業大學化保實驗室提供。

1.1.2 供試合歡種子

合歡為品種銀合歡（Leucaena leucocephala）（星河雙葉種業）。

1.1.3 供試培養基

NA培養基和PDA培養基的制作參照方中達所述方法。

1.2 使用方法及步驟

1.2.1 菌種活化及發酵液的制備

將HHY-3菌種從4℃冰箱取出，用滅菌的挑針挑取單菌落，在新的LB培養基上劃線，放于37℃培養箱中培養2-3 d即可。

將合歡枯萎病菌等5種病原菌用直徑為4mm打孔器，打成菌餅，將菌餅接入到新的PDA培養基中，5 d待用。

將活化后HHY-3菌株，用打孔器在細菌生長旺盛的地方打孔，用接種針挑取良好的菌餅，放置于NA培養基里，每6塊菌餅放置在一個三角瓶（含50 mL液體NA）中，放在30℃搖床中，在160 r/s條件下，發酵培養7 d。通過三層紗布過濾發醇液，去掉菌絲，過濾后的液體用小孔徑纖維素膜抽濾，得到細菌的無菌發酵液。

1.2.2 合歡種植

將合歡種子在0.3%甲醛溶液中浸泡15 min，用清水洗凈，用80℃熱水浸泡30 min。種植含有基質的育苗缽中（每個小缽邊長為5 cm），放到室溫下（20-30℃）生長，根據生長情況補充水分。

1.2.3 細菌的對峙抑制試驗

菌株采用平板對峙法篩選，對內生細菌進行抑菌測定，計算抑制率。以不接細菌為對照，3次重復。抑制率（%）=（1-處理菌落直徑/對照菌落直徑）×100。

1.2.4 接種與防治

進行灌根接種，使菌液均勻展布在葉片正反面，罩上塑料棚布，保濕24 -36 h。7-14 d后合歡陸續發病，開始調查病情，然后噴施相關藥劑進行防治，以噴施無菌水為對照。分別于14和21 d時

2 結論與討論

生物農藥不僅具有提高作物抗逆性，而且在維持生態平衡方面也有很大的作用。隨著國家落實可持續發展戰略的進程，加上人們對環境和生態保護的密切關注，生物農藥的研究開發越來越受到全社會的重視。我國政府也越來越重視可持續性發展，環境保護生態平衡，生產優質安全的農副產品是必然趨勢。微生物農藥具有種類多，易控制，能規模化生產等特點，且占生物農藥的絕大部分，是生物控制的重要方法。政府對微生物農藥的研發政策支持和經費投入都不斷加大，使科研人才尖端化設備先進化，科研人員對微生物農藥的研究逐漸深入。本試驗中，在合歡葉片中分離提取出的內生細菌HHY-3能夠抑制多種植物病原真菌。通過盆栽試驗表明，內生細菌HHY-3發酵液在一定水平上能夠防治合歡枯萎病害。雖然通過盆栽試驗證明菌株HHY-3發酵液可以很好地防治合歡枯萎病害，但需要2-3年甚至更多的時間對其進行田間試驗來對其防治效果和作用機制做進一步的研究，除此之外，關于該菌株在合歡植株中的寄生能力也需要更進一步研究，以便為該菌株在未來的開發和應用提供更為可靠的理論依據。

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