黃酒浸米水中微生物及細菌素研究進展

劉彩琴 陳虹 王楠等

黃酒浸米水中微生物及細菌素研究進展

劉彩琴，陳 虹，王 楠，金建昌 （浙江樹人大學生物與環境工程學院，浙江杭州 310015）

摘要 黃酒浸米過程中微生物是由群落控制的，大量的微生物和豐富的發酵產物是保障黃酒發酵在開放條件下正常和順利進行的關鍵因素之一。從浸米水中微生物及作用、具有抑菌活性的微生物及抑菌物質、乳酸菌產細菌素的特性等方面進行綜述，并對今后發展進行展望，以期為浸米水的綜合利用提供一定的參考價值。

關鍵詞 乳酸菌；細菌素；黃酒

中圖分類號 TS261.1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）32-0004-03

Research Progress of Antibiotics from Rice Steeping Water of Huangjiu

LIU Caiqin， CHEN Hong ， WANG Nan et al （College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University， Hangzhou，Zhejiang 310015）

Abstract Microorganism is controlled by community during rice soaking of Huangjiu.Large number of microorganisms and abundant fermented products are the key factors to ensure the Huangjiu fermentation successfully.This paper summarized the research progress of microorganism from rice steeping water of Huangjiu and its function， microorganism with antimicrobial activity and antibiotics， characteristics of bacteriocin produced by lactic acid bacteria .The future research areas were also resumed.It can provide reference for comprehensive utilization of rice steeping water.

Key words Lactic acid bacteria；Bacteriocin；Huangjiu

基金項目 浙江樹人大學紹興黃酒學院科研專項項目。

作者簡介 劉彩琴（1975—），女，甘肅涇川人，副教授，博士，從事食品科學研究。

收稿日期 2018-07-17

黃酒（Huangjiu）是以稻米、黍米等為主要原料，經浸米、蒸煮、加曲、糖化發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成[1-2]，是我國民族特產和傳統食品之一。黃酒浸米的主要目的是原料充足吸水，以保障發酵的順利進行與風味的產生，浸米過程中微生物及其豐富的發酵產物是保障黃酒發酵在開放條件下正常和順利進行的關鍵因素之一，同時其多種代謝產物對于黃酒風味和品質有重要影響，比如乳酸菌在發酵過程中產生的有機酸是黃酒風味物質的重要來源[3-4]。浸米水中含量豐富的營養物質有淀粉、蛋白質、糖類、有機酸等，其中氨基酸的種類多達18 種，還有微量元素、B族維生素和礦物質等[5]，還含有一些生理活性物質，其中抑菌物質的研究及應用還處于發展階段，但應用前景非常廣闊。該研究從黃酒浸米水中微生物的種類、產抑菌活性的微生物及細菌素特性進行綜述，以期為浸米水的綜合利用提供參考。

1 浸米水中微生物及作用

一般而言，微生物相互作用是微生物群落結構穩定形成的重要基礎，也是代謝產物分泌的基礎。黃酒浸米水中微生物是由群落控制的，大量的微生物和豐富的代謝產物對黃酒品質起關鍵作用。毛青鐘[6-7]應用傳統微生物培養技術研究發現，浸米水內微生物種類極其豐富，包括細菌、酵母菌和霉菌等類群；浸米前期，漿水表面主要是醋酸桿菌、乳酸桿菌，數量巨大，形成一層半透明狀的膜，隨后，有些浸米池表面又會形成泡沫花狀的白色膜，以產膜酵母、裂殖酵母和白地霉組成，這類微生物對浸米有害；浸米溫度越高，此膜出現的比例越大。漿水內的酵母以巨大酵母、假絲酵母和極少量的釀酒酵母等為主，數量少，對浸米水的產酸作用很小，而對漿水中產生的風味成分有一定作用。當浸米水的 pH小于4.5 時，球菌的數量已很少，很難檢測到。以后漿水酸度升高，浸米過程以桿菌的作用為主，浸米后期，乳酸桿菌所占比例越大（超過85%）。當浸米結束，僅有極少量的乳酸球菌（對生和四鏈生）存在，乳酸球菌存在于浸米的整個過程，數量非常少，只起到很小的作用。另外，尚有少量的芽孢乳桿菌屬和產乳酸的芽孢桿菌如凝結芽孢桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌等存在于浸米的整個過程，但數量非常少[6-7]。朱小芳等[3]通過分子生物學技術對傳統黃酒浸米水中細菌研究發現，浸米過程中乳酸菌屬為優勢細菌，其豐度含量占比為60.67%，有乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等，其中乳桿菌屬含量占乳酸菌的90%，57.4%的Lactobacillus為植物乳桿菌（L.plantarum），21.1% 的為短乳桿菌（L.brevis），其他種均不超過10%，如類食品乳桿菌（L.paralimentarius）等。在生產過程中，還有一些微生物雖參與黃酒的發酵，但是在傳統的培養過程中不能獲得其菌落及生物學信息，所以對其認識相當有限。

2 浸米水中分泌抑菌活性的微生物及抑菌物質

在長期的生產實踐中發現，相同工藝、相同底物發酵濃度釀成的紹興黃酒，因浸米時間不同（傳統攤飯法釀酒，浸米時間長達16～26 d，機械化黃酒生產時浸米時間縮短至2～5 d）[8]，其貯藏的安全性不一致，浸米時間長釀得的酒，入壇后能夠久藏不壞，反之則不易久藏，有人認為與浸米發酵過程中微生物代謝產物息息相關，這類物質統稱為抑菌成分，而且這種抑菌成分伴隨著發酵，最后進入成品黃酒中。能分泌抑菌物質的乳酸菌有乳球菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬等，抑菌物質有有機酸（乳酸、乙酸、苯甲酸、丙酸）、過氧化氫、CO2、雙乙酰、乙醛、D-氨基酸、抗真菌肽、羅氏菌素（reuterin）和細菌素（bacteriocins）等[9-10]。成瀟龍等[11]以金黃色葡萄球菌為指示菌研究發現黃酒釀造浸米水中抑菌物質為乳酸鏈球菌素。酵母分泌的抑菌物質研究較少，對僅有的一些報道分析發現：釀酒酵母IFST062013的抑菌能力與其分泌的α-干擾素（IFN-α）、γ-干擾素（IFN-γ）和白介素10（IL-10）有關[12]，釀酒酵母CCMI 885的抑菌能力與其分泌的抗菌肽 （AMPs）有關[13]。

3 乳酸菌產細菌素生物特性研究進展

乳酸菌在食品領域有很重要的生理功能，而其分泌的細菌素的開發及應用是目前研究的熱點之一。研究發現乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體途徑合成的一類具有抗菌活性的多肽類物質[14]，除了具有能被人體內的蛋白酶降解、不在體內蓄積等優點之外，還具有較好的穩定性及適合工業化生產的特點[15]，目前細菌素具有抗病毒[16]、調節腸道菌群[17-18]、促進植物生長[19]、抑菌[20]等功能，所以在食品、醫藥和獸藥等領域有廣闊的應用前景。美國 FDA 認證細菌素為 GRAS生物制劑。

目前，依據熱穩定性可將乳酸菌產生細菌素分為對熱穩定的Class I和Class II，以及對熱不穩定的Class III[21]。

Class I是由核糖體合成、翻譯后被修飾得到的一類肽類（RiPPs），分子量小于10 kD，包括所有合成過程中需要酶修飾的肽，經修飾之后氨基酸和結構更利于其功能的發揮，這些修飾如：羊毛硫氨酸、雜環化、N- 和C-端被一個肽鍵鏈接起來的環化和糖基化作用；Class I的基因里包含一個對酶識別、肽轉錄和控制肽失活的前導肽，此前導肽位于核心肽段上[22]。Class I的代表性物質有羊毛硫肽類化合物（Lanthipeptides），如 Nisin A；環化的肽類化合物（Cyclized peptides）如促腸活動素（Enterocin AS-48）；含吡咯或唑啉環的線性肽（LAPs，Linear azol（in）e-containing peptides）如鏈球菌溶血素（Streptolysin S）；Sactibiotics如 Subtilosin A；含有糖基片段類（Glycocins）如 Glycocin F；套索肽類（Lasso peptides）如E.coli產的Microcin J25。2010年Mkrtchyan等[23]從嗜酸乳桿培養液中分離得到分子量大小只有1.15 kD 的Ⅰ類細菌素，其氨基酸序列為Asn-Val-Gly-Val-Leu-X-Pro-Pro-X-Leu-Val。

Class II分子量小于10 kD，在合成過程中不需要修飾，理化性質穩定，又分為IIa、IIb、IIc 和IId 4 個亞類。IIa 類細菌素是II 類細菌素中主要的亞種，抗菌譜相比Ⅰ類細菌素較窄，僅對乳酸菌、李斯特菌等革蘭氏陽性菌表現出抗菌活性，極少數對大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性細菌表現抗菌活性[24]；以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）產生的乳酸片球菌素（Pediocin PA-1）為主要代表，具有保守的 N-末端YGNGVXC保守序列[15]；IIb 類細菌素是由2種不同的肽分子組成的多肽，當每種肽的肽比率相等時才會發揮協同作用，產生最佳抗微生物活性[25]，已報道的有乳球菌素G（lactococcin G）、萵苣苦素F（lactacin F）、乳桿菌素705（lactobacillin 705）、乳球菌素Q（lactococcin Q）、腸道菌素X（enterocin X）和腸道菌素NKR-5-3AZ（enterocinNKR-5-3AZ）[24，26]。Ⅱc 類細菌素的分子主鏈具有頭-尾環化的結構特征，已報道的有腸道菌素AS-48 （enterocin AS-48）、加薩霉素（gassericin A）、環孢菌素A、丁基弧菌素AR10、溶血素、卡諾菌素A、乳環素Q、加爾維因M （Galviin M）、白細胞環素Q（leucocyclicin Q）、環孢霉素和環孢霉素4185等[27]。Ⅱd 類細菌素包括非單線性肽，sec依賴性細菌素以及具有N-末端前導序列，并在翻譯后立即有活性的無前導序列細菌素，已報道的是從泰國發酵豬肉香腸中分離出的Bac7293A 和Bac7293B[25] 。

Class III 分子量大于10 kD，代表性物質之一如溶菌素（Bacteriolysins）是一種不耐熱的大分子抗菌蛋白，不同的結構域分別負責易位、受體結合和致死功能，以通過水解靶細胞的細胞壁使細胞溶解[28-29]；代表性物質之二為非裂解素（Non-lytic），其相關研究較少。

4 乳酸菌細菌素的抑菌機理

不同類型的細菌素抑菌機理不同，細胞膜蛋白、膜電位、pH、脂質組成、特定氨基酸和結構域等對抑菌活性有影響，總的來說包括細胞膜損傷機制、阻礙細胞分裂和細胞壁損傷機制[30-31]。

Nisin作為Class I的代表，被聯合國糧農組織和美國食品藥品管理局所認可并批量商業化生產，作為一種天然防腐劑被廣泛應用于食品的保鮮和預防食物中毒，它僅對蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、產氣莢膜桿菌（Clostridium perfringens）、鏈球菌（Streptococcus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）等革蘭氏陽性菌有抑制作用，對革蘭氏陰性菌沒有抑制作用，而且Nisin具有雙重的作用機制，Nisin濃度很低時，通過抑制細胞壁合成起作用；當Nisin濃度相對較高時，主要是通過孔膜形成來起作用[32-33]； Class II類細菌素的抗菌機理在近幾年才漸為人知，主要是由于細菌素吸附在細胞膜并在其上形成孔道，使得細胞膜的通透性增加，從而引起細胞內各種離子的滲漏和能量物質的消耗，導致細胞解體死亡[34]；Class III細菌素已發現的數量還不太多，研究也并不深入，具體作用機制還在研究[35]。

5 展望

黃酒是我國的民族特產和傳統食品，也是世界上最古老的飲料酒之一。浸米過程產生的浸米水是黃酒生產中的主要副產物，其中的乳酸菌產生的細菌素是天然的抗菌肽或蛋白質，潛在用于食品保藏和保健、飼料行業、醫療工業領域而備受關注，特別是在食品保藏方面具有巨大的潛在價值，其前景十分廣闊。Class II類乳酸菌細菌素具有較穩定的理化性質，為當前研究的熱點，但是研究相對較少。就目前應用效果來看，不同的細菌素聯合或細菌素與動植物來源的抗菌肽聯合使用可拓寬抑菌范圍和（或）增強抑菌效果。

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