高粱種質資源SSR標記遺傳多樣性與農藝性狀關聯分析

田承華 程慶軍 高海燕等

摘要 [目的]為充分了解高粱育種資源各性狀特性，指導高粱雜交組合的配置及分子標記輔助育種，應用分子標記對高粱種質進行遺傳多樣性分析，并尋找部分與農藝性狀相關聯的分子標記。[方法]利用SSR（simple sequence repeat，SSR）標記分析55份高粱種質資源的遺傳多樣性，同時對8個農藝性狀作表型鑒定，并利用GLM模型進行分子標記與農藝性狀的關聯分析。[結果]株高、穗寬、穗長、葉片數、旗葉長及寬等生長期性狀都符合正態分布，單穗粒重和千粒重也符合正態分布；各供試材料的8個農藝性狀均有極顯著差異。10對SSR引物共擴增出64條帶并檢測到39個等位變異；多態性信息量（polymorphism information content，PIC）變化范圍為0.685 6～0.948 3，平均為0.841 3；Shannon信息指數（I）和Neis基因多樣性指數（H）平均為1.195 8和0.617 0。在遺傳相似系數為0.731 7處UPGMA法將55份高粱材料聚為三大類，其中13份材料聚為A類，3份材料聚為B類，其余36份材料聚為C類。利用GLM模型分析結果表明，與穗寬、穗長、旗葉長、旗葉寬和千粒重5個農藝性狀相關聯的標記有4個，單個標記對表型變異的解釋率為0.014 7～1.360 5。[結論]該研究為高粱種質資源精準分類、種質優勢利用、育種效率提高等方面以及分子標記輔助育種提供基礎資料。

關鍵詞 高粱；SSR標記；農藝性狀；遺傳多樣性；關聯分析

中圖分類號 S514 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）32-0026-07

Genetic Diversity and Association Analysis Using SSR Markers and Agronomic Traits in Sorghum

TIAN Chenghua， CHENG Qingjun， GAO Haiyan et al

（Sorghum Institute， Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic and Germplasm Innovation in Sorghum for Shanxi Province， Jinzhong， Shanxi 030600）

Abstract [Objective] To understand the agronomic traits of sorghum germplasm and to direct sorghum hybrid combinations as well as molecular marker assisted breeding， the genetic diversity of sorghum germplasm was analyzed and the molecular markers associated with agronomic traits were searched. [Method] The genetic diversity of 55 sorghum germplasm resources were assessed by simple sequence repeat （SSR） markers. We identified the phenotypic of eight agronomic traits and found SSR markers associated with plant height， spike width， spike length， leaf blade number， flag length and width， spike weight and thousandgrain weight using GLM （General Linear Model）. [Result] Eight agronomic traits were consistent with normal distribution and there are very significant differences， a total of 39 alleles were identified with 10 SSR markers. The average polymorphism information content （PIC） varied widely from 0.685 6 to 0.948 3 with an average value of 0.841 3，the average of Shannons information index （I） and Neis gene diversity index （H） were 1.195 8 and 0.617 0， respectively. Clustering analysis with UPGMA showed that the 55 materials could be divided into three groups at the genetic similarity coefficient of 0.731 7， thirteen materials were grouped into Class A， three materials were grouped into Class B， and the remaining thirtysix materials were grouped into Class C. Four markers were found to be associated with spike width， spike length， flag leaf length， flag leaf width and thousandgrain weight using GLM （General Linear Model）， and the phenotypic variation explained by a single marker ranged from 0.014 7 to 1.360 5. [Conclusion] This research provided fundamental data for the accurate classification of germplasm resources， advantage utilization of germplasms， enhancement of breeding efficiency and molecular mark assisted breeding of sorghum.

Key words Sorghum；SSR；Agronomic traits；Genetic diversity；Association analysis

基金項目 現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-06）；山西省重點研發計劃重點項目（201703D211010）子項目“釀造專用高粱新品種選育”。

作者簡介 田承華（1982—），男，山西原平人，助理研究員，碩士，從事高粱遺傳育種研究。

收稿日期 2018-09-10

高粱（Sorghum bicolour）是一種重要的糧食、經濟、能源等多功能 C4作物，在世界干旱及半干旱區種植的主要糧食作物之一，并且光合作用效率高，生物產量和經濟產量大，同時具有很強的抗逆性和適應性，適合肥力貧瘠田的開發和利用[1]。高粱種質資源豐富，分布地域廣，地方栽培品種和變種較多，經過幾代高粱育種家60多年的研究發展，培育出大量優異的雜交種和種質資源。隨著分子生物技術的飛速發展，亟需高粱育種家加強收集與鑒定遺傳種質資源，同時需將農藝性狀與分子標記相結合，進而為復雜數量性狀的遺傳學研究和分子標記輔助育種奠定重要基礎。

隨著分子生物學技術的快速發展，同工酶、RAPDs、RFLPs、ISSRs、AFLPs、SSR、EST-SSR、基因芯片（DArTTM）和SNP等分子標記技術已應用于遺傳多樣性分析[2-3]。其中，SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）具有多態性高、數量豐富、重復性好、呈共顯性且廣泛分布于基因組等優點[4]，國內外有大量利用SSR標記進行高粱遺傳多樣性研究的相關報道。如Ni等[5]用25對SSR引物檢測了29份糯高粱種質資源的遺傳多樣性，在遺傳相似系數0.475處用UPGMA法將29份糯高粱品種聚為兩大類，不同地理來源的品種被聚在同一亞類，農藝性狀近似的品種聚為另一亞類；王瑞等[6]利用熒光測序與SSR分子標記相結合技術構建了20個高粱栽培品種DNA指紋圖譜，為品種鑒別提供依據；Sawadogo等[7]用15對SSR引物檢測了93份甜高粱種質資源的遺傳多樣性，結果聚為3大類，且A組（40份）與B組（43份）親緣最遠，B組與C組（9份）親緣最近；Yusuf 等[8]用10對SSR引物將Ethiopia的26份高粱種質資源聚為4個主要類群。這些研究證明遺傳多樣性分析對于育種材料的遺傳基礎研究具有重要作用。

關聯分析（association analysis）是基于連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）發現新等位基因的方法，可將目標表型性狀的多樣性與基因或位點的多態性相結合，分析與確定不同種質資源所攜帶的等位基因及其對應目標性狀[9]。這曾被廣泛應用于人類遺傳學，目前已應用于水稻[10]、玉米[11]、小麥[12]等農作物，而依據農藝性狀分析種質資源耗時、費力且周期長[13-14]。農藝性狀與SSR標記的關聯分析對群體結構分析顯得尤其重要，其中SSR 標記用于高粱關聯分析研究的報道較少。Upadhyaya等[15]利用43個SSR標記對242個高粱（Sorghum wlgare）品種的分蘗數和粒重進行關聯分析，檢測到1個標記與粒重相關、2個標記與分蘗數相關，確定1個氨基環丙烷羧酸合成酶基因（amino cyclopropane carboxylate，ACC）與分蘗數相關。

選育高粱品種是一個復雜漫長的過程，經過育種家長期的雜交與選育，積聚了多方面的優異種質，是目前最核心的遺傳資源庫。筆者應用SSR標記分析55份高粱種質資源的遺傳多樣性，并與8個農藝性狀進行關聯分析，從表型狀態和DNA水平來協同篩選優勢種質，為高粱種質資源精準分類、種質優勢利用、育種效率提高等方面以及分子標記輔助育種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為55份高粱種質，詳情見表1，于2017年3月種植于山西省農科院高粱所植物培養室，出苗后采取新鮮嫩葉作為試材。

CTAB、Tris、飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、Taq酶、dNTPs等均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 高粱生長指標的測定

1.2.1 田間試驗設計。

55份高粱種質資源單株表型鑒定于2017年在山西省農科院高粱研究所試驗田（中國晉中榆次）進行。采用5個重復的隨機區組設計，選地塊均勻，高低一致，水分管理方便的大田。試驗材料設為單行區，行長5 m，行距 0.75 m，15 cm株距，種植密度大約為82 500株/hm2。每行隨機選擇5個單株用標簽標示，調查標簽標示單株表型。

1.2.2 大田農藝性狀調查。

準確記載試材的出苗期、抽穗期和完熟期。成熟后隨機考查不同試材的6個單株表型，包括株高、穗長、穗寬、葉片數、旗葉長和旗葉寬等性狀。收獲單穗考種和干燥脫粒，記錄單穗粒重和千粒重。利用SPSS 21.0軟件對相關性狀進行數據統計分析。

1.3 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法[3]進行試材基因組DNA的提取，利用分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳法進行DNA濃度和純度檢測。

1.4 SSR引物序列與SSR擴展體系及電泳檢測

參照國內外相關文獻[16]，挑選40對SSR引物作為候選引物，委托上海生物工程技術有限公司合成。PCR反應在EDC-810熱循環儀上進行，反應體系為：模板DNA 2 μL、10×PCR buffer（mg2+ Plus）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.25 μL、0.1 mmol/L 引物 2 μL、1.25 U Taq DNA聚合酶，加ddH2O補足25 μL。

擴增結束后，每個PCR管加入6 μL上樣緩沖液（98% 甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH=8.0，0.25% 溴酚藍，0.25% 二甲苯青），混合后置于冰水混合物中。在電泳槽中加入足夠的0.5×TBE緩沖液（0.09 mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA，pH 8.0），用吸管吹凈點樣孔中的氣泡，加2 μl擴增產物混合物，100 W恒功率下，8%聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳分離120 min，電泳結束后銀染10 min，NaOH顯色3 min，蒸餾水清洗3次，掃描記錄[17]。

1.5 數據處理與分析

利用SPSS 21.0軟件分析8個高粱關鍵農藝性狀的正態分布和Q-Q-plot，并計算Pearson相關系數，以檢測農藝性狀間的線性相關關系。

對擴增譜帶進行數據統計，強擴增帶記為“1”，無擴增帶或者弱擴增帶記為“0”，得到原始數據，根據不同軟件的格式要求做相應轉換。NTSYS-pc軟件進行遺傳多樣性分析并基于UPGMA法繪制聚類樹，計算遺傳相似系數（genetic similarity，GS）；Popgene 32計算Shannon指數（I）、Neis基因多樣性指數（H）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）；Structure 2.3.1軟件分析群體遺傳結構；Tassel 5.0以一般線性模型（general linear model，GLM）進行關聯分析，GLM分析中以Q值作為協變量進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 高粱農藝性狀調查

從圖1可以看出，株高、穗寬、穗長、葉片數、旗葉長及寬、單穗粒重和千粒重8個農藝性狀都符合正態分布，并且所有農藝性狀大體上呈連續變異，表明為多基因控制的數量性狀。從表2中可以看出，株高、穗寬、穗長、葉片數、旗葉長、單穗粒重和千粒重等偏度均大于0，說明分布成正偏態；而旗葉寬偏度小于0，說明分布成負偏態。

2.2 55份高粱供試材料的8個農藝性狀及其差異分析

利用 SPSS對8個農藝性狀的平均值、極差、標準差和變異系數進行計算。標準差在不同種質材料間存在較大差異，依次為穗粒重>株高>旗葉長>千粒重>穗長>葉片數>穗寬>旗葉寬。在8個性狀中，標準差最大的是穗粒重16.71，變幅為53.50～127.70。標準差最小的是旗葉寬1.17，變幅為4.20～8.10。由此可知，各高粱試材穗粒重和其平均值間的差異較大，而旗葉寬與其平均值間的差距最小（表2）。由表2可知，8個性狀的變異系數為10.89%～19.53%，其中穗粒重的變異最大，其次是千粒重，兩者變異系數均大于19%；而葉片數的變異最小，為10.89%。

對8個農藝性狀間的線性相關分析表明，穗長與株高，穗寬與穗長，葉片數與穗寬，旗葉寬與旗葉長，穗粒重與穗長，千粒重與穗粒重之間均呈極顯著正相關（P<0.01）；旗葉寬與穗寬，穗粒重與株高，穗粒重與穗寬，穗粒重與旗葉長間呈顯著的正相關（P<0.05），其他性狀之間沒有顯著的相關性（表3）。

2.3 SSR引物篩選及多態性分析

由表4可知，從40對引物中篩選出10對多態性豐富、擴增譜帶清晰的引物；對55份高粱材料遺傳多態性分析，共獲得64條DNA擴增片段，其中有39個等位變異，平均多態性條帶百分率（PPB）為60.937 5%，分子量為200～1 000 bp。多態性信息量（PIC）變化范圍為0.685 6～0.948 3，平均值為0.841 3，以引物Xcup02最低，引物gpsb069最高，這說明引物Xcup02的遺傳多樣性較豐富，而引物gpsb069的遺傳多樣性較狹窄。

10對引物的等位變異數（NA）變幅為2～8條，平均3.9條；有效等位變異數（NE）為1.273 7～8.509 1，平均為3.206 6；Shannon信息指數（I）變幅為0.456 7～2.250 3，平均為1.195 8；觀察雜合度（Ho）變幅為0.072 7～0.981 8，平均為0.745 5，反映雜合位點在基因組中所占比例高；期望雜合度（He）的變化幅度為0.216 3～0.744 0，平均為0.622 7，表明試材普遍存在雜交，雜交率較高。Neis基因多樣性指數（H）的變化幅度為0.214 9～0.882 5，平均為0.617 0，表明所選引物擴增的多態性存在較大的差異，遺傳多樣性豐富。經10個SSR標記掃描分析，55份高粱材料的遺傳相似系數（GS）變異范圍為0.355 0～0.968 3，平均值為0.747 7。其中，765與763的GS值最大（0.968 3），表明二者親緣關系最近；776與772GS值最小，為0.355 0，說明二者親緣關系最遠。

2.4 SSR高粱種質聚類分析

采用NTSYS-pc 軟件基于 UPGMA 法進行聚類分析，圖 2表明55份高粱材料在GS值為0.7317處被聚為3個大類。A類包含13份材料；3份材料聚為B類，750獨自為一小類；738和751為另一小類；C類材料來源較豐富，其余36份材料聚為一類。

2.5 參試材料群體結構分析

應用已篩選出多態性豐富的10個 SSR 標記進行群體遺傳結構分析，結果發現樣本的等位變異頻率特征類型數K呈持續增大（圖 3A）。Structure 2.3.1軟件對參試材料進行群體結構劃分，由圖3B可以看出ΔK在K=7時出現拐點，由此判斷55份高粱群體可被分為 7 個亞群，并繪制供試材料群體結構圖（圖4），將各個材料的對應Q值作為協變量納入SSR標記與表型性狀變異的回歸分析中。

2.6 SSR標記與農藝性狀關聯分析

采用 TASSEL 5.0 軟件的一般線性（general linear model，GLM）模型進行引物標記位點與農藝性狀的關聯分析，以各試材的對應Q值為協變量，將SSR標記基因型與高粱8個農藝性狀（株高、穗寬、穗長、葉片數、旗葉長及寬、單穗粒重和千粒重）進行關聯分析，GLM結果顯示，共檢測到 4個標記與5個農藝性狀在P<0.01水平上相關，表型變異解釋率為 0.014 7～1.360 5（表 4）。其中，gpsb089標記與穗寬和旗葉寬極顯著相關；Xcup02標記與穗長極顯著相關；mSbCIR240與旗葉長極顯著相關，解釋率最大為1.360 5；Xtxp141與穗寬和千粒重極顯著相關，解釋率分別為0.014 7和1.058 7，與穗寬的解釋率最小。

3 討論

3.1 高粱SSR分子標記遺傳多樣性分析

種質資源是進行育種工作的基礎，豐富的遺傳種質資源是育種材料創新及優異基因聚合的基礎條件。因此分析種質資源的遺傳多樣性、比較種質間親緣關系的遠近，對于選育工作和種質資源的利用尤其重要。利用SSR分子標記技術進行高粱遺傳多樣性的研究，國內外已有報道[18-21]。該研究選用的10對SSR 標記能夠較全面地分析55份高粱材料的遺傳多樣性，共獲得64條DNA擴增片段，有39個等位變異，多態百分率（PPB）為60.937 5%，其多態性信息量（PIC）、Shannon信息指數（I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Neis基因多樣性指數（H）的平均值分別為0.841 3、1.195 8、0.745 5、0.622 7和0.617 0。GELETA等[19]利用AFLPs、SSRs和農藝性狀來評估45份高粱種質資源的遺傳多樣性，其中多態性信息量（PIC）分別為0.65（AFLPs）和0.46（SSRs），Shannon信息指數中農藝性狀（0.678）比AFLP（0.487）和SSR（0.539）都較高，同時AFLP和SSR都可以標識所有的種質，而通過形態學有2個種質無法區分開。在遺傳相似系數為0.731 7處UPGMA法將55份高粱材料聚為三大類，A類包含13份材料，B類包含3份材料，C類包含36份材料，通過與材料組合比較來看，基本上組合相近的材料大部分聚為一類。但也有部分材料如（748-758、998-999）等，這表明在育種家對育種材料選擇的過程中，在不同的選擇壓力與方向上使相同來源的種質資源表現較大差異的基因型和表型。因此，在育種中對于材料的分類運用必須依靠分子標記技術進行準確的分類鑒別，從而提高育種材料的鑒定利用效率。趙香娜等[20]用24對SSR引物分析206份國內外甜高粱種質資源的遺傳變異，在遺傳相似系數0.762將其分為兩大類，其中B組只包含3個品種，與其他品種遺傳關系較遠。倪先林等[21]用25對SSR引物檢測29份糯高粱種質資源的遺傳多樣性，在遺傳相似系數0.475處聚為兩大類，不同地理來源的品種被聚在同一亞類，農藝性狀近似的品種聚在同一亞類。這些都充分地利用SSR標記將不同類別、地域的高粱種質資源區分開來，進而為篩選優質育種材料提供基礎依據。

3.2 高粱分子標記的關聯分析

關聯分析通過分析種質資源中標記與QTL間關系，直接對基因型和表型的變異進行分析，可確定不同種質資源中所攜帶的等位基因及其對目標性狀的貢獻[9]。種質資源進行遺傳多樣性及群體遺傳結構分析，是關聯分析的前提[22]。在遺傳相似系數為0.731 7水平上將55份高粱材料聚為3個大類，分別包括 13、3和36份材料，而基于GLM模型的群體結構分析表明，這些資源可以分為7個亞群，分別包括8、13、6、4、14、3和7份材料，兩者的結果差異較大。出現這樣的差異主要因素是聚類分析反映個體間親緣關系的遠近，而群體遺傳結構分析是基于亞群是否達到哈德溫伯格平衡的數學模型并計算Q值[23]，該研究利用Structure軟件校正55份材料所存在的群體結構，可避免人為因素對亞群劃分的影響[24]。利用GLM模型進行關聯分析發現，與穗寬、穗長、旗葉長、旗葉寬和千粒重5個農藝性狀相關聯的標記有4個，其中，gpsb089與穗寬和旗葉寬關聯標記；Xcup02與穗長關聯標記；mSbCIR240與旗葉長關聯標記，Xtxp141與穗寬和千粒重關聯標記。Bhosale等[25]發現一些SNP標記與非洲中西部高粱材料的光周期開花時間基因 CRYPTOCHROME 1（CRY1-b1）和 GIGANTEA（GI）相關。GELETA等[19]利用AFLPs、SSRs和農藝性狀來評估45份高粱種質資源的遺傳多樣性，發現AFLP和SSR標記以及形態學和SSR標記的遺傳關系的估計值顯著相關（P<0.001），而形態學和AFLP數據顯示無顯著相關性（P>0.05）。Upadhyaya等[15]利用43個SSR標記對242個高粱（Sorghum wlgare）品種進行關聯分析，檢測到1個標記與粒重、2個標記與分蘗數相關。由此通過農藝性狀與分子標記進行相關性分析，就可找到與目標性狀相關聯的標記，可用于分子標記輔助選擇育種，提高優選效率，通過表型鑒定與分子標記相結合，相互驗證可加速目標基因的聚合，縮短連續選擇時間，提高選擇效率，進而為高粱優良種質創新提供理論方法依據。

4 結論

8個農藝性狀間部分性狀存在顯著或極顯著的線性相關性，以GLM模型關聯分析發現4個SSR標記與5個農藝性狀在P<0.01水平上相關，表型變異解釋率范圍為0.014 7～1.360 5，為高粱農藝性狀的分子標記輔助選擇奠定了基礎。

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