產pseurotin A內生真菌GYP8的鑒定

姜碩 許哲祥 王宇晴等

摘要 [目的]研究甘草內生真菌GYP8活性代謝物，豐富pseurotin A植物內生真菌資源庫。[方法] 利用HPLC法對GYP8發酵液進行分析；采用柱色譜分離法對GYP8 活性成分進行分離、純化；采用形態特征觀察法及18SrDNA 序列分析對內生真菌GYP8進行菌種鑒定。[結果]內生真菌GYP8發酵液中含有pseurotin A，經鑒定該菌為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。[結論] GYP8是pseurotin A產生菌，該菌的獲得可為pseurotin A成分的生產提供新方法。

關鍵詞 pseurotin A；內生真菌；鑒定

中圖分類號 R931 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）32-0085-03

Identification of Pseurotin Aproducing Endophytic Fungus GYP8

JIANG Shuo1，2， XU Zhexiang1，2， WANG Yuqing1，2 et al

（1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150500；2.Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective]To study the active metabolites of endophytic fungi GYP8 from Glycyrrhiza uralensis and enrich the pseurotin A endophyte resource pool. [Method]The fermentation broth of GYP8 was analyzed by HPLC.The positive components of GYP8 were separated and purified by column chromatography.Strain identification of the endogenous fungi GYP8 was performed by morphological observation and 18SrDNA sequence analysis.[Result]Compound pseurotin A was isolated from the fermentation broth of GYP8 and endophytic fungus GYP8 was identified as Aspergillus fumigatus.[Conclusion] GYP8 is a pseurotin Aproducing endophytic fungus， which provides a new means for development and application of pseurotin A.

Key words Pseurotin A；Endophytic fungus；Identification

基金項目 黑龍江省自然科學基金項目（面上項目）（H2015003）。

作者簡介 姜碩（1997—），女，黑龍江大慶人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。*通訊作者，教授，博士，從事微生物制藥研究。

收稿日期 2018-09-27

pseurotin A為重要的微生物次生代謝產物，是酰胺類生物堿[1]，也是重要的生化試劑，是阿樸嗎啡拮抗劑，能抑制殼聚糖合成和單胺氧化酶活性，具有誘導細胞分化、抗菌和免疫調節作用，其主要生產渠道為從微生物代謝產物中分離得到[2]。

筆者在課題組前期研究的基礎上，對具有潛在應用價值的烏拉爾甘草內生真菌GYP8發酵液進行分析檢測，發現其發酵液中含有pseurotin A，該化合物首次從子囊菌（Pseudeurotium ovalis STORK）發酵液中分離得到[3]。隨著對pseurotin A活性的深入研究，人們開始對pseurotin A及其類似物進行化學合成以提高產量，但化學合成生產pseurotin A具有環境污染、試劑消耗高、成本高等缺點，因此發掘新型高產pseurotin A菌株是目前研究的課題。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養

供試菌為內生真菌GYP8，分離自野生烏拉爾甘草葉（采集地為黑龍江省大慶地區）。PDA培養基同參考文獻[4]。

1.2 儀器與試劑

FL2200高效液相色譜儀（浙江溫嶺）。

18SrDNA擴增通用引物NS1（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3）和NS6（5-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

試劑：甲醇為色譜純級別，其他試劑均為分析純。

1.3 內生真菌GYP8發酵液制備

取已活化的甘草內生真菌GYP8接種于60 mL液體馬鈴薯培養基中（搖床培養28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×107 CFU/mL種子培養液。取種子液以5%（V/V）的接種量轉接至300 mL 液體馬鈴薯培養基中（搖床培養28 ℃，140 r/min，14 d），抽濾，濾液于50 ℃減壓濃縮，作為發酵液供試品。

1.4 GYP8發酵液中活性成分分析與分離

1.4.1 GYP8發酵液中活性成分分析。

取“1.3”供試品，40 ℃真空減壓抽干后，加入1 mL甲醇溶解，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取濾液作為供試品溶液。采用HPLC法，分別精密吸取 0.5 mg/mL 的pseurotin A對照品液及供試品液各 10 μL 注入HPLC儀器，HPLC檢測條件為Venusil XBP-C18柱（柱4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動相為甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶0.5）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm。

1.4.2 GYP8發酵液中活性成分分離。

取“1.3”制備GYP8菌株發酵液10 L，50 ℃減壓濃縮至200 mL，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液后減壓濃縮，進行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶5為洗脫劑，用薄層鑒別（TLC）對其進行檢測（GF254薄層板，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=15∶15∶2）（100 mm×200 mm），依據TLC檢識結果，合并成分相似或相同的洗脫液；得粗晶體后二次硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶15為洗脫劑，根據薄層鑒別結果合并洗脫液，回收溶劑，重結晶，得到化合物單體。

1.5 內生真菌GYP8的鑒定

1.5.1

內生真菌GYP8形態學鑒定。參考文獻[5]方法進行。采用平板PDA培養基培養GYP8（28 ℃，7 d），觀察形態特征；同時取同培養2 d的GYP8 PDA平板，將滅菌蓋玻片傾斜插入該平板中，繼續培養3 d，取出，取蓋玻片，清除背面附著物，顯微鏡下觀察GYP8菌株的孢子顯微特征，初步確定菌株的分類地位[6]。

1.5.2

內生真菌GYP8 18SrDNA序列擴增及序列分析。參閱文獻[7]方法進行。PCR 產物純化后，測序工作委托上海生工生物工程股份有限公司完成。所測得序列提交GenBank 數據庫，利用MEGA5.05構建系統發育樹，確定GYP8菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 GYP8發酵液中活性成分分離結果

2.1.1 GYP8發酵液中活性成分分析結果。按“1.4.1”HPLC分析，甘草內生真菌GYP8發酵液中可能含有pseurotin A，供試品色譜中，在與pseurotin A對照品相同保留時間位置上，有相同的色譜峰出現（圖1），PDA空白培養基相應保留時間位置未見任何色譜峰出現。

2.1.2

GYP8發酵液中活性成分分離結果。按“1.4.2”分離方法所得為無色粉末狀結晶。薄層鑒別結果顯示，該晶體與pseurotin A對照品在相同位置顯相同顏色斑點（圖2）。MS鑒定結果為Positive MS：454.3[M+Na]+，885.4[2M+Na]+，Negetive MS：429.9[M-H]-，861.5[2M-H]-。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δ：4.57（dd，J=6.4，8.8 Hz，H-11），5.36（dd，J=8.8，9.8 Hz，H-12），

2.2 內生真菌GYP8鑒定結果

2.2.1

內生真菌GYP8形態學鑒定結果。甘草內生真菌GYP8菌落翠綠色，邊緣白色，產生翠綠色粉末，基質淡黃色（圖4）；甘草內生真菌GYP8菌株的分生孢子呈穗圓筒形，顏色深淺不一，分生孢子梗綠色光滑無突起，頂囊向外突出呈現燒瓶狀，且只有上半部產生孢子（圖5）。

2.2.2

內生真菌GYP8 18SrDNA序列擴增及序列分析結果。甘草內生真菌GYP8 DNA經PCR擴增獲得1條1 305 bp的特異性條帶（圖6），將測序結果在GenBank中進行Blast同源性比對，然后用MEGA5.05軟件構建系統發育樹（圖7），內生真菌GYP8序列（登錄號：KR233004）與Aspergillus fumigates（M60300.1）序列的同源性最高，相似性為99%。綜合鑒定結果，確定甘草內生真菌GYP8為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

3 結論

該研究從烏拉爾甘草葉片中分離得到內生真菌GYP8，對其進行活性代謝物研究發現，在其發酵液中存在大量活性化合物，并且存在與宿主植物烏拉爾甘草相似的化合物。選擇內生真菌GYP8作為研究對象，對其進行系統研究，從其發酵液中分離得pseurotin A，對菌株GYP8進行菌種鑒定，結果為煙曲霉（Aspergillus fumigatus），該菌株為pseurotin A產生菌。

參考文獻

[1] LI X J，ZHANG Q，ZHANG A L，et al.Metabolites from Aspergillus fumigatus，an endophytic fungus associated with Melia azedarach，and their antifungal，antifeedant，and toxic activities[J].J Agric Food Chem，2012，60（13）：3424-3431.

[2] MITCHELL J M，FINNEY N S.Synthetic studies of pseurotin A：Preparation of an advanced lactam aldehyde intermediate [J].Org Biomol Chem，2005，3（23）：4274-4281.

[3] ISHIKAWA M，NINOMIYA T，AKABANE H，et al.Pseurotin A and its analogues as inhibitors of immunoglobuline E production[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters，2009，19（5）：1457-1460.

[4] 徐慧超，孫婷媛，翟李欣，等.產甘草次酸內生真菌RE7的鑒定及抑菌活性研究[J].中國新藥雜志，2016，25（1）：102-105.

[5] 吳桐，白長勝，譚佳音，等.烏拉爾甘草內生真菌的分離及其抑菌活性研究[J].中國食品學報，2014，14（2）：154-160.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[7] YANG Q X，ZHANG J，ZHU K F，et al.Influence of oxytetracycline on the structure and activity of microbial community in wheat rhizosphere soil[J].Journal of environmentan sciences，2009，21（7）：954-959.

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