高效液相色譜法測(cè)定小葉女貞果實(shí)中山柰酚的含量

楊亞熹 郭向群

[摘要]目的：研究小葉女貞果實(shí)中山柰酚的酸水解提取條件，建立高效液相色譜法測(cè)定小葉女貞果實(shí)中的山柰酚含量的方法，并分析不同來(lái)源藥材中山柰酚的含量差異。方法：小葉女貞果實(shí)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為 20%的鹽酸-甲醇溶液（1：4）水解提取后，用高效液相色譜法測(cè)定其水解液中的山柰酚的含量。以Inertsil ODS-SP（5μm，250×4.6mm）色譜柱，乙腈- 0.3%磷酸水溶液（37：63）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速為 1.000ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 370nm;柱溫為35℃。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)考察結(jié)果表明，山柰酚進(jìn)樣量在 0.192～1.152μg范圍內(nèi)的峰面積與吸光度有良好線性關(guān)系，其回歸方程為y=5E+06x+18.723，r=0.9998;平均回收率為 98.64%（RSD%=1.89，n=6）;在此測(cè)定條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為 1.52%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為 1.42%，該測(cè)定方法的重現(xiàn)性較好;9批不同來(lái)源小葉女貞果實(shí)樣品中山柰酚含量有一定差異，平均含量為0.3506mg/g，RSD為0.18%。結(jié)論：酸水解提取-高效液相色譜法可用于小葉女貞果實(shí)中山柰酚的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法;小葉女貞果實(shí);山柰酚;含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)]R284.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

小葉女貞（Ligustrum quihoni Carr.）又名小葉冬青，在全國(guó)各地均有分布，資源豐富。其根葉可入藥，具有清熱解毒的功效，可治療外傷、燙傷等癥。經(jīng)文獻(xiàn)檢索和資料查閱，該植物果實(shí)的藥用未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)記載。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道小葉女貞中含有齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚及揮發(fā)油等化合物;其提取物具有免疫調(diào)節(jié)、止咳平喘及清除自由基的作用;山柰酚的抗菌、抗病毒、抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病的防治作用備受關(guān)注。小葉女貞果實(shí)中山柰酚至今尚未見(jiàn)有含量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC測(cè)定小葉女貞果實(shí)中山柰酚的方法，該方法簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

LC-20A色譜儀（島津），SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（島津）;MS105型分析天平（梅特勒-托得多儀器有限公司）;K-Q500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司）;DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上海科析試驗(yàn)儀器廠）。

1.2 藥品及試劑

山柰酚對(duì)照品（批號(hào)為ST0105，上海如吉生物科技）;乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司），其余所用試劑均為分析純。

1.3 藥材

藥材9批，于冬至前采集，經(jīng)天然藥物教研室陸鴻奎副教授鑒定為木犀科女貞屬植物小葉女貞（Ligustrum quihoni Carr.）的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取山柰酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用甲醇溶解制成每1ml含山柰酚0.0960mg的對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取藥材樣品粗粉（過(guò)2號(hào)篩）1g，精密稱(chēng)定，用石油醚50ml回流1小時(shí)，藥渣揮干石油醚后，加入20%鹽酸溶液15ml，乙酸乙酯60ml水浴回流提取1小時(shí)，濾過(guò)，濾液用40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH5～6后于水浴濃縮至干。殘?jiān)眉状既芙猓?5000r/min離心10min，定容為50ml，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作樣品溶液。

2.3 色譜條件

用Inertsil ODS-SP（5μm，250×4.6mm）色譜柱，在370nm波長(zhǎng)、35℃柱溫條件下，進(jìn)樣10μl，流速為1.000ml/min，以乙腈-0.3%磷酸水溶液（37：63）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取2.1和2.2 項(xiàng)下制備的對(duì)照品和供試品溶液各10μl，按2.3 色譜條件項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果，供試品中山柰酚色譜峰的保留時(shí)間為9.09，與對(duì)照品溶液一致，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于4 000，溶劑空白無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖 1。

2.5 線性關(guān)系考察

按2.3色譜條件項(xiàng)下方法，精密吸取2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6，12μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)得山柰酚面積的回歸方程為y=5E+06x+ 18.723，r=0.9998。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，在上述色譜條件下，山柰酚進(jìn)樣量在0.096～1.152μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。山柰酚線性關(guān)系見(jiàn)圖2。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別吸取2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10μl，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定6次，其峰面積RSD 為1.63%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批藥材（采于楚雄醫(yī)專(zhuān)校園內(nèi)的藥材），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后 0，2，4，8，12，24h 進(jìn)樣10μl，測(cè)得山柰酚的峰面積RSD為 1.52%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批藥材粗粉（過(guò)2號(hào)篩）6 份，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各10μl注入高效液相色譜儀，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量分析，山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為 1.42%，表明該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知山柰酚含量的藥材粗粉（過(guò)2號(hào)篩）6份，精密稱(chēng)定，每份約2g，分別加入山柰酚對(duì)照品適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)得山柰酚的平均回收率為98.64%（n=6），RSD=1.89，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品測(cè)定

取藥材樣品粗粉（過(guò)2號(hào)篩）1 g，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl，按 2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算山柰酚含量。同法測(cè)定9批樣品（批號(hào)見(jiàn)表2），每批樣品平行測(cè)定三次，其測(cè)定結(jié)果的平均值見(jiàn)表2。

3 討論

在提取條件的選擇中，為藥材中的山柰酚由苷水解為游離狀態(tài)，常在提取溶劑中加入一定量的酸進(jìn)行水解。筆者考察了甲醇-2%鹽酸、乙醇-2%鹽酸、乙酸乙酯-2%鹽酸等為提取溶劑進(jìn)行回流和超聲提取，結(jié)果顯示，以乙酸乙酯-2%鹽酸（4：1）為溶劑進(jìn)行超聲提取效果最佳。

洗脫劑的選擇，考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸水溶液的等度和梯度洗脫的情況，最終選擇用乙腈-0.3%磷酸（37：63）洗脫進(jìn)行等度洗脫分離較好。用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)山柰酚用上述條件在波長(zhǎng)200～400nm繪出3D圖譜，結(jié)果山柰酚于370nm波長(zhǎng)處的HPLC色譜響應(yīng)較大，同時(shí)各色譜峰分離度較好，故選擇370nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

建立的方法穩(wěn)定性、回收率、重復(fù)性和分離效果較好，能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定小葉女貞果實(shí)中山柰酚的含量，可用于小葉女貞果實(shí)中山柰酚的含量測(cè)定。

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