動物肌肉發育相關印記基因研究進展

賀花 何帆 黃永震 姜艷芬 郭抗抗 王晶鈺 張彥明

摘要 就印記基因的發展過程、主要特點及作用機制進行了簡要概述，并主要介紹了與肌肉的生長發育密切相關的部分印記基因（DLK1、SNRPN、IGF2和H19），印記基因的作用原理以及對肌肉發育的影響。

關鍵詞 動物；肌肉發育；印記基因；甲基化

中圖分類號 S813 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0029-03

Research Progress on Imprinted Gene Related to Development of Animal Muscle

HE Hua1， HE Fan2， HUANG Yongzhen3 et al

（1. College of Veterinary Medicine， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；2. College of Food Science and Engeneering， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；3. College of Animal Science and Technology， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract Discovery process， main features and mechanism of action of imprinted genes were summarized.Part of imprinted genes （DLK1，SNRPN，IGF2 and H19） which was associated with the growth and development of animal muscle was introduced. Working principles and its influences to muscles were described.

Key words Animal；Muscle development；Imprinted gene；Methylation

基金項目 國家自然科學基金青年科學基金項目（31601926）；中國博士后科學基金面上項目（2015M570856）；陜西省博士后科研項目資助基金（2016BSHYDZZ44）；陜西省自然科學基礎研究計劃一般項目（面上）（2017JM3012）；西北農林科技大學2017年大學生創新創業訓練計劃（S201710712086）。

作者簡介 賀花（1985—），女，陜西咸陽人，實驗師，博士，從事本科教學實驗室管理和動物性食品衛生檢驗相關研究。

*與第一作者具有同等的貢獻。

收稿日期 2018-05-31；修回日期 2018-06-15

隨著科學研究的發展與進步，科學家們逐漸意識到并發現了隱藏在人類基因中的一種特殊的基因，即印記基因。研究表明，來自親本雙方的兩個等位基因，在遺傳過程中進行了修飾作用，造成了子代中一個基因表達而另一個基因不表達或表達不顯著的現象，這一現象被叫做基因組印記（Genomic Imprinting）。其中，父（母）源印記指的是來自父（母）方等位基因不表達者，能產生印記效應的單等位表達基因稱為印記基因（Imprinted Genes）。目前對發現的少數印記基因的研究表明，印記基因功能強大且作用很廣泛，該發現對現代醫學與生物學都做出了較大貢獻。其中，在動物肌肉生長發育的調控因素的研究中，也發現了印記基因的關鍵作用，引發了科學家在此領域的探索。

1 印記基因的發現及其特點

1.1 印記基因的發現

歷史上關于印記基因現象的最早報道出現于1960年，Crouse[1]在Sciara昆蟲（屬尖眼蕈蚊科尖眼蕈蚊屬，是一種雙翅目的小型昆蟲，分布范圍廣，食物來源繁雜，通常繁殖并生存在畜糞豐富、垃圾多、潮濕及腐殖質豐富的地方）的X染色體中發現，等位基因中來自于父方的基因不能正常表達發揮作用，反而只有來自于母方的基因可以正常表達。在此之后，于20世紀80年代，科學家在對小鼠的細胞進行核移植的試驗時，發現了位于哺乳動物體內染色體上的印記基因。1984年，Barton等[2]發現，當2個細胞核來自同一個個體時，其只能在初期發育，到發育后期就會死亡；而只有當2個細胞核來自2個不同個體時，就得以正常存活并繼續生長發育。根據現在已有的科學研究得知，同一來源的2個細胞核組成的個體之所以會在早期發育而后期死亡，是由某些印記基因的作用引起的。繼而于20世紀90年代初，有3個試驗室分別在對小鼠的試驗中發現了3種具有重要意義的印記基因，分別是：父源印記基因IGF2、母源印記基因IGF2R和H19。這一發現是印記基因的研究歷史上的里程碑式的進步[3-5]。

大量研究表明，印記基因主要存在于4類物種中，分別是真獸類哺乳動物、有袋類動物、種子植物和人類。2000年，Koski等[6]發現雞的IGF2基因在其胚胎發育期間表現出印記現象，同年O Neill等[7]報道稱IGF2基因在雞的胚胎發育期是父源和母源的2個等位基因在同時表達，而雞的M6 P/IGF2也沒有出現印記現象。而有關鳥類的印記基因的研究則出現了一些矛盾的現象，因此不能明確其是否真的具有印記基因。通常情況下認為魚類、爬行類和兩棲類（部分鯊魚也是有胎盤的）等是不含有印記基因的。

1.2 印記基因的特點

印記基因的特點主要是以下幾個方面：（1）根據親本來源，在來自父方與母方的等位基因中，僅有一方的等位基因會表達，以使來自兩方的基因組表達而表現不同的功能；（2）富含CpG島（CpG是胞嘧啶C-磷酸 p-鳥嘌呤 G的縮寫，常出現在真核生物編碼基因的調控區），十分容易被高度甲基化修飾，表明在印記狀態的維持上，甲基化修飾發揮著重要的作用；（3）在DNA基因組上，印記基因很少單獨存在，而往往是多個相連著出現，這表明印記基因相互之間存在著某種共線性的作用，因此多個印記基因的區域才會相連出現[8]；（4）印記基因具有印記遺傳的組織特異性，具體來說，在遺傳印記的過程中，相同的一對等位基因只在特定的個體部位表現印記效應，即只表達父源或者母源一方的等位基因，而在另外的組織器官等，兩者都會表達，不顯示印記效應[9]；（5）目前關于印記基因的研究，大部分出現于小鼠或者人類，可見印記基因具有物種間的保守性[9]；（6）存在包括H19基因在內的少量印記基因，它們不會最終翻譯生成蛋白質，但是轉錄生成RNA的過程卻會發生[9]；（7）約有15%的印記基因的反義鏈是可以通過轉錄生成RNA的，并且這些RNA的生成也屬于遺傳印記，且是父方等位基因的表達，但不包括Tsix（Xist的反義序列，Xist即X- inactive specific transcript，失活X染色體特定轉錄，Tsix為Xist的負向調節因子），其它多數印記基因的反義鏈都只轉錄不翻譯[9]。（8）在DNA的復制過程中，印記基因具有復制時可以不同時發生的特性[10]。

2 印記基因的印記機制

哺乳動物印記基因的印記過程，一般大致可以分為3個部分，分別是印記的形成、印記的維持與印記的去除。在哺乳動物成熟的配子中，印記已經形成，而且印記將持續存在直到出生以后。有一點值得說明的是，在卵母細胞的核移植試驗中，科學家發現，當對應DNA被甲基化修飾后，才可以獲得基因印記，反之則不能獲得。而前文中也有提到過，對于印記基因的維持來說，甲基化是一個必要的因素。基因印記的去除發生在原始生殖細胞的早期階段，而這個階段中的印記基因的甲基化修飾還在繼續維持。而在染色體復制時，甲基化修飾無法繼續維持，因此，母方的去甲基化過程是被動進行的。在囊胚階段時，甲基化修飾會在內細胞團中重新進行。在受精時及受精后，甲基化修飾過的等位基因將繼續其甲基化狀態，沒有被甲基化修飾過的等位基因將繼續其非甲基化的狀態。在囊胚期，遺傳印記將建立。而在胚胎期之后，遺傳印記僅出現于各組織器官，原始生殖細胞中的基因印記將被清除。

3 印記基因的調節機制

3.1 啟動子修飾模式

印記基因的啟動子中含有大量的鳥嘌呤和胞嘧啶，而且其往往在此中的某個等位基因中是高度甲基化的。該過程后，啟動子無法和轉錄因子結合，從而抑制該等位基因轉錄，繼而抑制基因的表達。甲基化CpG結合蛋白2（Methyl CpG binding Protein 2，MeCP2）、組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）等構成復合體，在組蛋白H4上，發生去乙酰化修飾這一過程，最終使得染色體發生緊縮，從而基因轉錄生成RNA被抑制[10]。

3.2 邊界元件的作用模式

順式阻遏效應是許多印記基因差異甲基化區域（Differentially Methylated Region，DMR）經過甲基化修飾后所具有的，通過甲基化修飾作用，個體自身的等位基因就不能夠繼續表達，失去了活性。但也有另一種作用效果，對于部分印記基因DMR來說，甲基化修飾會活化自身等位基因從而進行正常的表達作用。這一誘導作用主要通過隔離蛋白與邊界元件之間的作用來進行。例如，隔離蛋白CTCF因子是邊界元件CCCTC序列的基因特異性結合因子。在交互印記IGF2/H19中，印記中心（Imprinting Center，IC）是一段長約2 kb的DNA片段，位于IGF2和H19之間。在父方表達的等位基因中，通過甲基化修飾IC，由于CTCF因子不再能夠與其正常結合，因而使增強子優先作用于IGF2基因，于是H19基因被抑制正常作用，IGF2基因開始表達。相反，在母方表達的等位基因中，由于IC沒有被甲基化修飾，不影響CTCF因子與之正常結合，因此IGF2基因被抑制轉錄，而在H19基因的啟動子上增強子發揮作用，H19基因能夠正常表達[10]。

4 與動物肌肉發育相關的印記基因作用機制及其研究進展

4.1 DLK1

DLK1（Delta-like 1 Homologue）是目前已知的印記基因中的其中一種，它表現為父源等位基因表達而母源等位基因沉默[11]。研究表明，它參與了多種細胞的增殖、分化調節的過程，發揮不可忽視的作用[12]。DLK1屬于表皮生長因子的一種。DLK1與GTL2（Gene Traped Locus 2）是一對印記基因，人的DLK1基因全長1 557 bp，編碼序列中含有1 152個核苷酸，編碼383個氨基酸殘基[13]。

在DLK1與GTL2這對印記基因中，DLK1是父源表達，母源沉默的印記基因（此基因在人、羊、鼠中高度同源）；而GTL2印記基因是僅有母源表達的。DLK1印記基因定位于人的14號染色體、小鼠的12號染色體以及綿羊的18號染色體[13]。在人14號染色體上，目前已知DKL1印記基因有3個DMR區域，分別是DKL1基因3端的DMR區域，位于GTL2基因上游15 Kb的基因間差異甲基化區以及包括了GTL2基因的啟動子和第一外顯子的DMR區域[14]。這些甲基化區域調控著該基因印記的表達，決定了一對等位基因是由父源表達還是由母源表達。例如，位于小鼠12號染色體上的DKL1基因表達的是父源等位基因，由該基因編碼合成是一種跨膜糖蛋白，與Delta/Notch信號轉導有關，能夠維持細胞的正常分化和增殖[15]。經研究發現，DLK1基因的作用機制與GTL2基因是緊密聯系的，與位于小鼠7號染色體上的印記基因組IGF2/H19作用機制十分相似[10]。DLK1和IGF2基因同樣都是在去甲基化修飾過程后，表達作用被抑制，從而間接地促進了GTL2基因和H19基因的表達[13]。

研究表明，DLK1基因能夠調節肌細胞和人骨骼肌干細胞的分化，并且在胎盤類哺乳動物的生長發育過程中，對肌肉的發育有促進作用，而抑制脂肪組織的生長[16-17]。

4.2 SNRPN

SNRPN（encode Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide N）基因是編碼小核核糖核蛋白多肽N的印記基因，其作用是與前體RNA結合，從而影響RNA的選擇性剪接[18]。SNRPN基因在鼠和人中均為父源等位基因表達[19-20]，其在鼠的肺、肝、脾、腎、子宮、睪丸和腦等組織器官中都有表達，但在腦中表達量最高[21]。另一研究發現，仔豬的SNRPN基因在心臟、肌肉中的表達量均低于其他組織，心臟中的表達量較低這一現象在嚙齒類動物中可能存在著種間差異[22]。人的SNRPN基因定位于染色體15 q11-q13的PWS/AS區域[18]，Glenn等[23]通過Northern Blot試驗發現SNRPN在腦的不同部位都高表達，包括下丘腦，這表明SNRPN基因在下丘腦中極有可能發揮了重要的不可替代的作用。在對人和鼠中的研究試驗中發現，該印記基因異常表達時是會影響到個體神經系統的發育進程的。同時相關研究表明，在豬中該基因在神經系統中高度表達，這說明該基因對神經系統的發育有著重要影響和作用[22]，而到個體成年時，其各組織器官中該基因的表達達到了相對穩定，只有在心臟、骨骼肌中的表達量是略微低于其他組織器官中的表達量的[24]。同時，研究發現SNRPN基因在豬的各個時期的胎盤中都能夠穩定表達，沒有大的起伏和變動，這可能與SNRPN基因的功能有一定關系[22]。還有研究表明該基因同時與細胞的分化、細胞的增殖、胚胎的發育以及一些精神行為等有關聯[25-28]。由此可見，SNRPN基因不僅在胎盤功能和仔豬生長發育過程中發揮著重要的作用，而且在肌肉的生長發育過程中也起到了重要作用。

同樣在下丘腦中高度表達的還有NDN（Necdin）基因和UBE3A（Ubiquitin-protein ligase E3A）基因，雖然在肌肉中表達量較低，但也發揮了作用，促進生長[22]。

4.3 IGF2和H19

IGF2（Insulin-like Growth Factor 2）基因是胰島素樣生長因子之一，主要在胎兒的發育時期、腫瘤細胞的增殖分化時期以及肌肉的生長方面發揮重要的調節作用。由于IGF2基因與肌肉的生長密切相關，因此該基因是影響豬胴體瘦肉率和背膘厚度的基因中重要的候選基因之一[29]，與之相關的試驗也進一步說明了IGF2基因對肌肉生長的關鍵影響。研究表明，15～23周齡的公豬，其IGF2基因印記濃度與背膘厚度呈負相關，說明IGF2基因對于脂肪組織的積累有反向調節作用[30]。1986年，Florini等[31]提出了IGF2基因的作用方式是通過對濃度的控制達到促進肌纖維的增殖和分化的目的。

H19基因位于IGF2基因的下游，只轉錄RNA，而不翻譯形成蛋白質，是母源表達、父源沉默的印記基因，H19基因是以轉錄形成RNA的形式來發揮功能和作用的，一般認為H19基因參與了IGF2基因的表達調控[32-34]。研究發現，H19和IGF2基因是一對相互影響的印記基因組。在H19基因作用時，其抑制了母源染色體的轉錄過程，從而降低了IGF2印記的濃度[29]。

通過對瘦肉型品種長白豬和脂肪型品種藍塘豬的研究，可得知IGF2基因和H19基因在豬脂肪沉積和生長發育上發揮了重要作用和影響，同時發現其在豬早期的肌肉等組織的生長發育過程中起到了重要作用，證實了IGF2基因和H19基因與動物肌肉生長發育密切相關，從而發揮關鍵性作用[28-29]。

5 印記基因應用前景

盡管印記基因的數量只占人體基因總數的很小的比例，但它們的表達會對個體的整個生長發育過程都有著重要影響，由此來看，印記基因的作用研究無疑將會是未來研究的重點。相信在生命科學技術日益發展和完善的今天，印記基因的研究與應用將成為科學家們的又一熱門研究領域。除了生長發育，如果能在成體組織中對印記基因功能進行更深入的分析，或許將有助于了解動物遺傳疾病、腫瘤等的發病機理，并使這些疾病能夠得到一定的解決或改善。

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