市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

摘要 [目的]通過對石河子地區市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性的分析，評估該區域鮮牛奶的安全性。[方法]采用稀釋涂平板法分離金黃色葡萄球菌，結合接觸酶、兔血漿凝固酶試驗，nuc基因擴增，16S rRNA基因測序進行鑒定。同時，選用K-B紙片法測定分離菌株的耐藥性。[結果]從10份樣品中分離得到金黃色葡萄球菌16株。其中，47.8%的菌株表現為多重耐藥，12株金黃色葡萄球菌對頭孢他啶具有耐藥性。[結論]樣品中金黃色葡萄球菌多重耐藥性嚴重，應該采取相應的措施加以監管。

關鍵詞 牛奶；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥性

中圖分類號 TS207.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0173-03

Isolation， Identification and Antibiotic Resistance Analysis of Staphylococcus aureus in Commercially Available Fresh Milk

GAO Xuan

（Agricultural Products Quality and Safety Testing Center of Midong District， Urumqi， Xinjiang 830000）

Abstract [Objective]Through the analysis of the isolation，identification and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from commercial available fresh milk in Shihezi area， the safety of fresh milk in the region was evaluated. [Method]Staphylococcus aureus was isolated by dilution plate method and catalase test and coagulase test， nuc gene amplification and 16S rRNA gene sequencing were performed. At the same time， the KB disk method was used to determine the antibiotic resistance of the isolates. [Result]Sixteen strains of Staphylococcus aureus were isolated from 10 samples. Among them， 47.8% of the strains showed multidrug resistance， and 12 strains of Staphylococcus aureus were resistant to ceftazidime. [Conclusion] Staphylococcus aureus in the sample has serious multidrug resistance， and appropriate measures should be taken to supervise and administrate it.

Key words Milk；Staphylococcus aureus；Identification；Antibiotic resistance

作者簡介 高璇（1988—），女，山東金鄉人，助理農藝師，從事農產品檢測研究。

收稿日期 2018-05-20

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性細菌，在自然界中廣泛存在，可以產生多種毒素和酶，致病性很強。據報道，近年來由金黃色葡萄球菌引起的細菌性感染占第二位，僅次于大腸桿菌[1]。同時，在不清潔的環境中金黃色葡萄球菌頻繁地污染食品，如肉、禽、蛋、奶及其制品，從而引起多種感染，包括皮炎、胃腸炎和中毒性休克綜合征等[2]。金黃色葡萄球菌能產生高溫滅菌不能破壞的腸毒素，可對人體造成危害[3]。作為食源性致病菌，金黃色葡萄球菌的耐藥問題也已成為影響公共衛生的重大難題[4-5]。我國奶牛專業型的大規?；B殖相對較少，尤其在游牧民族聚居的地方主要以小規模的方式自由散養。非專業型的養殖大部分圈舍衛生條件差，擠奶方式、規律不科學，很容易引起奶牛乳房被金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等感染，導致奶?；既榉垦住Ｄ膛Ｈ榉垦淄鹉膛Ｃ谌闇p少或者停止，甚至結束奶牛的產乳生涯。青霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素等抗生素常常用于奶牛乳房炎的治療。長期使用相同的抗生素會引起耐藥性微生物的富集，并且在人、奶牛、牛奶之間循環傳播[6]。近幾年，不同的“超級細菌”不斷被發現，由其引起的感染性疾病嚴重威脅人類健康[7]。因此，牛奶、牛乳房炎來源的病原微生物及其耐藥性引起了廣大學者的關注[8-10]。筆者對石河子地區市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌進行分離、鑒定及耐藥性分析，掌握牛奶中金黃色葡萄球菌的分布及菌株耐藥性，為牛奶安全性評估及抗生素的使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養基購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；PCR擴增試劑及引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他分析或生物純化學試劑購自Solarbio公司；抗生素紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Tprofessional PCR儀，德國Biometra公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel Doc TM XR凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；Fresco21型離心機，德國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集。

從市場散售儲奶桶中無菌移取50 mL樣品于100 mL滅菌離心管，編號、封口后置于冷藏盒中，2 h內運回實驗室進行處理。

1.3.2 分離純化。

參考文獻[11]，移取25 mL均勻的牛奶樣品置于裝有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，150 r/min振蕩混勻10 min，制成10-1梯度的樣品稀釋液，移取1 mL稀釋液用裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管進行稀釋，得到10-2梯度稀釋液。原液、10-1、10-2這3個梯度移取200 μL均勻涂于Baird-Parker平板，37 ℃倒置培養36 h。挑取表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，邊緣淺色，用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感特征的單菌落進行轉接純化3次后，在營養肉湯中補充25%的無菌甘油保藏于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 接觸酶及兔血漿凝固酶試驗。

挑取純化后的單菌落溶于3%的H2O2溶液中，1 min內產生氣泡，則為接觸酶陽性，反之為陰性。接觸酶陽性菌株分別接種至5 mL BHI培養基，36 ℃培養24 h，移取500 μL至細菌微量生化鑒定管（兔血漿），封口并置于37 ℃，每30 min觀察一次，直至6 h。如呈現凝固或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結果，否則為陰性，試驗設置3個重復。

1.3.4 Nuc基因檢測。

參考Brakstad等[12]的方法，提取接觸酶、兔血漿凝固酶陽性菌株的基因組DNA。采用特異性引物Primer 1（5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′）和Primer 2（5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′）對金黃色葡萄球菌的nuc基因進行PCR擴增。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目標片段為267 bp。

1.3.5 16S rRNA基因擴增、測序。

通過細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rRNA基因的擴增。擴增體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL；引物各1 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 補足25 μL。擴增反應：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30個循環；72 ℃終延伸7 min。PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進行測序，測序結果利用BLAST進行在線序列同源性分析[13]。

1.3.6 耐藥性檢測。

將金黃色葡萄球菌接種至10 mL BHI培養基，37 ℃富集24 h。用生理鹽水調整菌液濃度至（1.5～2.0）×108 CFU/mL，移取200 μL均勻涂布于TSA培養基上，將10種抗生素紙片分別等距貼于平板表面，靜置30 min，37 ℃培養24 h， 測定抑菌圈直徑，試驗設計3個平行。根據國際現行的臨床實驗室標準化協會（簡稱 CLSI）[14]制定的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》判定菌株對抗生素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 菌株分離

10份鮮牛奶中分離純化得到23株疑似菌株，6份樣品檢測到金黃色葡萄球菌，檢出率為60%。其中， NN9樣品未檢測到菌株，從NN3、NN4、NN7樣品中分離的菌株接觸酶、兔血漿凝固酶試驗均呈陰性，不符合金黃色葡萄球菌的特征。接觸酶、兔血漿凝固酶試驗陽性菌株16株（表1）。

2.2 Nuc基因

Nuc基因擴增結果如圖1所示，菌株NN1-3、NN5-2擴增結果為陰性，其余14菌株為陽性，目標片段介于200～300 bp。

2.3 16S rRNA基因測序結果

16S rRNA基因測序序列比對結果表明，16株純培養物均為金黃色葡萄球菌，與GenBank數據庫中已知序列的相似性為99%～100%（表1）。

2.4 金黃色葡萄球菌耐藥性

金黃色葡萄球菌耐藥性統計見圖2，菌株NN2-1對所測10種抗生素均敏感，25%的菌株對1～2種抗生素表現為耐藥，11株金黃色葡萄球菌表現為多重耐藥（47.8%）。其中，2株菌株對6種抗生素具有耐受性，2株菌株可耐受5種抗生素。16株金黃色葡萄球菌對IMP、AMX、STR均敏感，12株菌株對CAZ耐藥，11株耐受PEN，其余抗生素耐藥性菌株為4～9株。張倩等[15]對石河子地區奶牛乳房炎源的金黃色葡萄球菌進行了耐藥性分析，結果表明，青霉素和紅霉素耐藥率分別為71.67%、46.67%，與該研究結果（68.8%和37.5%）較為接近。

3 結論

該研究10份鮮牛奶中6份樣品共檢測到16株金黃色葡萄球菌，47.8%的菌株表現為多重耐藥。其中，對頭孢他啶（CAZ）和青霉素（PEN）耐藥的菌株分別為75.0%和688%。

奶牛的乳房炎嚴重影響牛奶的產量和質量，制約奶牛養殖業的發展。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要病原菌之一，由其引起的乳房炎占50%以上[16]。在生產實踐中，飼養者通過長期的抗生素給藥來預防奶牛患乳房炎，以此增加養殖效益。因此，大量的抗生素耐藥性微生物在奶牛中產生，并且耐藥性基因出現水平和垂直的傳播，多重耐藥性病原微生物富集，通過牛奶、排泄物等進入自然環境，嚴重威脅人類健康。該研究結果表明，該區域牛奶中金黃色葡萄球菌耐藥性嚴重，尤其，對青霉素、桿菌肽等至今仍被臨床廣泛用于治療人畜感染性疾病的抗生素耐藥性菌株比例較高。由此得出，需要對奶牛養殖業采取一定的衛生和抗生素管理及相關知識的普及措施，并加大對牛奶相關安全指標的監管力度。

46卷27期 高 璇 市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

參考文獻

[1] 劉丕龍.奶牛乳腺炎來源的葡萄球菌甲氧西林抗性傳播的機制研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2017.

[2] GCKOG ˇ LU A，KEVENK T O，UYANIK T，et al.Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in raw milk and dairy products by multiplex PCR[J].Journal of food science，2012，77（11）：620-623.

[3] 薛秀恒，孫茂忠，王菊花，等.安徽不同地區奶站牛奶中金黃色葡萄球菌及其腸毒素污染狀況評估[J].中國微生態學雜志，2012，24（4）：302-306.

[4] LE HOIR Y，BARON F，GAUTIER M.Staphylococcus aureus and food poisoning[J].Genetic molecular research，2003，2（1）：63-76.

[5] MARTN M C，FUEYO J M，GONZLEZHEVIA M A，et al.Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks[J].International journal of food microbiology，2004，94（3）：279-286.

[6] 王桂琴，楊萌萌，邢燕，等.寧夏地區奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性分析[J].動物醫學進展，2011，32（10）：59-62.

[7] 邱梅，郝智慧，張萬江，等.動物源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].中國農學通報，2011，27（7）：356-359.

[8] 李自然，施春雷，宋明輝，等.上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況[J].食品科學，2013，34（1）：268-271.

[9] TURUTOGLU H，HASOKSUZ M，OZTURK D，et al.Methicillin and aminoglycoside resistance in Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis and sequence analysis of their mecA genes[J].Veterinary research communications，2009，33（8）：945-956.

[10] FESSLER A，SCOTT C，KADLEC K，et al.Characterization of methicillinresistant Staphylococcus aureus ST398 from cases of bovine mastitis[J].Journal of antimicrobial chemotherapy，2010，65（4）：619-625.

[11] 國家食品藥品監督管理總局，國家衛生和計劃生育委員會.食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社，2017.

[12] BRAKSTAD O G，AASBAKK K，MAELAND J A.Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene[J].Journal of clinical microbiology，1992，30（7）：1654-1660.

[13] JUST A，THOMMA B P，LIEVENS B.Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in foodassociated matrices and processes[J].Food microbiology，2008，25（6）：745-761.

[14] FALLIS A G.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Clinical and Laboratory Standards institute，CLSI[J].Journal of chemical information and modeling，2013，53（9）：1689-1699.

[15] 張倩，屈勇剛，于會舉，等.石河子地區奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2017（2）：102-105，291.

[16] 趙艷坤，劉慧敏，王帥，等.奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥性研究進展[J].生物技術通報，2018，34（10）：40-48.