一株山羊源腸炎沙門氏菌對小鼠的致病性研究

譚爍 馮帆 陳極奎 湯承　岳華

摘要 [目的]探討山羊源腸炎沙門氏菌（swun3816）對小鼠的致病性。[方法]從四川省某山羊養殖場腹瀉糞便中分離出1株腸炎沙門氏菌，采用灌胃途徑測定swun3816 對BALB/c小鼠的半數致死量，根據毒力測定結果選擇合適的劑量，建立swun3816感染小鼠模型，并于感染后6、12、24、48、72、96 h隨機選擇3只小鼠進行剖檢，觀察其大體病變，同時采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腸道等器官，制備石蠟切片，觀察其病理組織學變化。[結果]經灌胃途徑接種102～108 CFU/mL swun3816均可致小鼠的不同程度發病和死亡，LD50為155.6 CFU/只；用5×103 CFU/只劑量給小鼠灌胃，建立了swun3816小鼠模型，感染小鼠最初出現精神沉郁、食欲減退和眼部漿液性滲出物等癥狀，感染后8.5 h開始出現死亡，第6天出現死亡高峰，剖檢可見肺臟淤血和出血斑，脾臟淤血腫大，肝臟表面有大小不一的不規則灰白色壞死灶；腸液分泌增多呈黃色，小腸黏膜出血，腸壁變薄。病理組織學觀察顯示，肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、心臟出現變性、壞死和炎性細胞浸潤等病變，十二指腸、空腸和回腸絨毛斷裂脫落；盲腸、結腸、直腸在整個試驗期間未見明顯病變。[結論]山羊源腸炎沙門氏菌swun3816能引起小鼠全身性感染，具有很強的致病力。

關鍵詞 腸炎沙門氏菌；致病性；病理組織學變化；山羊

中圖分類號 S852.61+2 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）13-0090-05

Study on the Pathogenicity of a Strain of Salmonella enteritidis from Goat to Mice

TAN Shuo，FENG Fan，CHEN Jikui et al （College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan 610041）

Abstract [Objective] To investigate the pathogenicity of Salmonella enteritidis strain （swun3816）from goat to mice.[Method] A strain of Salmonella enteritidis was isolated from the faeces of diarrhea goats in a goat farm of Sichuan Province.The median lethal dose（LD50） of swun3816 strain to BALB/c mice was determined by intragastric administration.The appropriate dose was selected according to the determination results of toxicity and the pathological model of swun3816 infected mice was established.Three mice were randomly chosen to make autopsy after infecting 6，12，24，48，72 and 96 h.And the general pathological changes were observed，and heart，liver，spleen，lung，kidney，intestinal tract and other organs were collected to make parafin sections and observe histopathological changes.[Result] When mice was injected with 102～108 CFU/mL swun3816 strain by intragastric administration，different levels of morbidity and death were caused，LD50 was 155.6 CFU/ind..When the intragastric dose was 5×103 CFU/ind.，pathological model of swun3816 strain was established.At first，the infected mice performed the symptoms of depression，loss of appetite and serious exudate in the eyes，etc..The death appeared after infecting 8.5 h and the peak of the death appeared on the sixth day.From the autopsy results，blood spots in lungs，congestion in swollen spleens，and irregular grayish necroses on liver surface were found.Intestinal lesion included increased yellow secretion，bleeding intestinal mucosa and thinning intestinal wall.Histological and pathological examination showed degeneration，necrosis and inflammatory cell infiltration were seen in liver，kidney，lung，spleen and heart.The intestinal villi of duodenum，jejunum and ileum broke off and fell away，while cecum，colon and rectum remained normal in all experiments.[Conclusion] Salmonella enteritidis swun3816 strain from goat could cause systemic infection in mice with a strong pathogenicity.

Key words Salmonella enteritidis；Pathogenicity；Histopathological change；Goat

絕大多數沙門氏菌對人和動物都有致病性，很容易在動物與動物、動物與人以及人與人之間傳播[1]。沙門氏菌在宿主腸道內生長繁殖，通過腸上皮細胞進入體內，并通過血液循環導致全身感染和菌血癥，引起發熱及腹瀉[2]。畜禽攜帶的沙門氏菌很容易通過動物產品的食物鏈成為人類的重要來源[3-4]，沙門氏菌引起的食物中毒約占細菌性食物中毒的42.6%～60.0%，在世界大多數國家沙門氏菌引起的食源性疾病占微生物性食源性疾病的首位[5]，在我國，沙門氏菌性食物中毒事件多年來也一直占據細菌性食物中毒事件的首位[6]，世界衛生組織（WHO）將沙門氏菌列入具有嚴重危害和中等危害的食物傳播性病原。據歐洲食品安全局（EFSA）報道，匈牙利2013年零售的生鮮畜禽肉中沙門氏菌平均檢出率為18.6%[7]；Mihaiu等[8]報道羅馬尼亞生鮮雞肉、豬肉中沙門氏菌的平均檢出率為22.9%；Thai等[9]報道越南鮮雞、豬肉中沙門氏菌的平均檢出率均為41.1%。畜禽感染沙門氏菌后可呈無癥狀帶菌，會降低動物的繁殖力，或者可能加重病情或死亡率，也引起致死性疾病，造成巨大的經濟損失。腸炎沙門氏菌主要引起人類的食物中毒和胃腸炎以及畜禽的腸炎。王晶晶等[10]研究表明四川省部分集約化山羊養殖場沙門氏菌的健康帶菌率為54.59%。迄今為止，國內對山羊源腸炎沙門氏菌致病性的研究資料甚少。筆者對一株山羊源腸炎沙門氏菌對小鼠的致病性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 培養基及試劑

BPW增菌液、TTB增菌液、SS培養基，均購自杭州微生物試劑公司；沙門氏菌A-F多價診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.2 實驗動物及臨床樣本

BALB/c雌性小鼠（SPF），體質量為（20±2）g ，購自成都達碩實驗動物有限公司；腹瀉糞便來自四川省某肉山羊養殖場。

1.3 沙門氏菌的分離與鑒定

1.3.1 增菌。取1 g左右糞便樣接種于BPW增菌液中，（36±1）℃下培養24 h。移取1 mL BPW增菌液轉種于10 mL TTB增菌液中（42±1）℃培養24 h。

1.3.2 分離與純化。培養后的TTB增菌液劃線接種于SS培養基，（36±1） ℃培養24 h，從每個培養基上挑取3～5個圓形、有光澤、隆起、光滑的疑似菌落接種于SS培養基，進行純培養。

1.3.3 沙門氏菌的鑒定。用A～F多價血清與分離菌株的純培養進行玻板凝集試驗，陽性菌株送至四川省疾病預防控制中心進行鑒定。

1.4 LD50的測定

將沙門氏菌分離株（swun3816）接種于TSB培養基，37 ℃培養18 h，采用比濁法測定細菌濃度，以西南民族大學動物醫學實驗室建立的回歸方程計算各稀釋度的菌落形成單位（CFU），用TSB將菌液進行10倍遞增稀釋，使其終濃度為102～108 CFU/mL。將35只小鼠隨機分為7組，每組5只，于灌胃前3 h停止喂食和飲水，組①～⑦分別灌胃接種不同濃度的沙門氏菌，0.5 mL/只。灌胃后各組小鼠隔離飼養，自由采食和飲水，逐日觀察并記錄各組小鼠發病死亡情況，采用Bliss法計算 LD50。

1.5 感染模型的建立 根據LD50的測定結果選擇感染劑量，通過灌胃途徑接種沙門氏菌分離株，每次接種5只小鼠，建立感染小鼠模型，試驗重復3次，以確保模型的穩定性。

1.6 病理組織學觀察

沙門氏菌分離株灌胃接種18只小鼠，用于建立感染模型，分別于接種后6、12、24、48、72、96 h隨機取出3只，無痛處死，分別摘取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸等器官，用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，HE染色并鏡檢，另選取3只小鼠灌胃等體積TSB，并于灌胃后6 h，采用與模型組相同的方法處死小鼠并采樣制備石蠟切片，作為健康對照組。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定結果

從山羊腹瀉糞便樣本中分離沙門氏菌疑似菌落，純培養物與沙門氏菌A～F多價血清的玻板凝集試驗為陽性，分離菌株swun3816經四川省疾病預防控制中心血清學鑒定為腸炎沙門氏菌。

2.2 swun3816對小鼠的致病性

2.2.1 臨床癥狀。7個劑量的swun3816經灌胃途徑接種小鼠，均可引起不同程度發病和死亡。小鼠最早于感染后3 h開始出現臨床癥狀，表現為被毛粗亂、蜷縮弓背、精神不振、兩側眼睛流出漿液性眼淚、眼周被毛濡濕（圖1a）、步履蹣跚、呼吸急促等癥狀，并隨著感染時間的延長而逐漸加重，8.5 h后開始出現死亡。

2.2.2 swun3816對小鼠的LD50。不同劑量swun3816對小鼠的致死情況見表1。

對表1中數據采用Bliss方法進行計算，得出swun3816對小鼠的LD50為155.6 CFU/只。

2.3 swun3816感染小鼠模型的建立

選擇經灌胃途徑給小鼠接種swun3816，接種量為5×103 CFU/只，發現小鼠在96 h內全部死亡，臨床癥狀和大體病變與 “2.2.1” 相似，3次重復試驗結果一致，說明感染模型成功建立且穩定。

2.4 大體病變

小鼠肺臟嚴重淤血，表面有大量出血斑（圖1b）；脾臟淤血腫大，邊緣鈍圓，體積為正常小鼠的2～3倍（圖1c）；肝臟淤血腫大，表面可見大量不規則的灰白色壞死灶（圖1d）；腸道充盈，內容物多呈淡黃色黏液樣。小腸淤血，其余腸段未見明顯病變。對照組小鼠未見病變。

2.5 swun3816感染小鼠的病理組織學變化

2.5.1 肝臟。感染后12 h，肝細胞出現廣泛性的空泡變性，空泡較小（圖2a）；感染后24 h，肝細胞空泡變性更加嚴重，空泡變大變多（圖2b）；感染后48 h，竇狀隙充血（圖2c），肝細胞索出現核溶解、消失的無核細胞結構；感染后72 h，出現少量散在、較小的、具有藍染核碎片的凝固性壞死灶；感染后96 h，竇狀隙嚴重充血，肝組織出現大面積島狀分布的凝固性壞死灶（圖2d）。

2.5.2 腎臟。感染后12～96 h，腎小管上皮細胞腫脹，廣泛空泡變性，腎小管管腔變小甚至消失（圖3a），腎小管管腔內有均質淺紅色染的管型，間質部分血管擴張充血（圖3b）。

2.5.3 肺臟。感染后12～96 h，肺泡隔廣泛增厚（圖4a），擴張充血；感染后72 h，支氣管管腔中出現含有少量炎性細胞的淡染蛋白滲出液（圖4b）；感染后96 h，支氣管出血。

2.5.4 脾臟。感染后12 h，脾臟出現團塊狀均質、粉染結構（圖5a）；感染后72 h，脾髓紅細胞數量明顯增加（圖5b）；感染后96 h，出現凝固性壞死灶（圖5c）。

2.5.5 腸管。感染后24 h，回腸絨毛開始出現斷裂脫落（圖6a）；感染后72 h，十二指腸和空腸絨毛開始出現斷裂脫落（圖6b、圖6c）；盲腸、結腸、直腸未見明顯病變。

2.5.6 心臟。心肌輕微淤血，心肌纖維間隙內可見少量的紅細胞。

3 討論

沙門氏菌血清型眾多，不同血清型以及不同菌株的毒力差異很大。Swearingen等[11]采用口服方法感染BALB/c小鼠，測定了不同宿主源的6個亞種17個血清型共計32株沙門氏菌對小鼠的致病性，結果僅有2株沙門氏菌可致死小鼠，其LD50分別為1.6×105 和4.5×105 CFU/只，而另外30株均未引起小鼠產生明顯的臨床癥狀。因此，在經腸道感染小鼠建立沙門氏菌的感染模型時，通常要給試驗小鼠長時間大劑量口服的抗生素，以破壞腸道正常菌群，從而提高口服感染模型的成功率[12-13]。該研究中羊源腸炎沙門氏菌swun3816經口服途徑感染，可致死未經抗菌素處理小鼠，其LD50為155.6 CFU/只，可見該菌株具有很強的毒力，說明該菌株具有很強的侵襲力，能迅速突破腸道菌群的屏障，在宿主體內繁殖并向全身擴散蔓延，進而引起致死性疾病。該菌株是否存在較為獨特的突破腸道防御屏障的侵襲性因子或毒力因子，有待進一步研究。

沙門氏菌可自然感染各種年齡段的人和動物，出現多種不同的臨床癥狀，主要表現為傷寒、副傷寒、胃腸炎、腹瀉和敗血癥，也可引起全身性感染，導致嚴重的綜合征[2，14-15]。swun3816經消化道感染引起小鼠出現精神沉郁、呼吸困難、流淚和死亡，感染導致小鼠主要組織器官出現腫大、壞死、細胞空泡變性、炎性細胞浸潤等病變，說明該菌株經消化道感染可引起小鼠的全身性感染，其主要癥狀與病理變化與國內的相關研究結果一致[16-20]。swun3816經口服途徑感染致小鼠出現眼炎，研究顯示沙門氏菌感染可引起家禽結膜炎或者失明[21-23]，但未見腸炎沙門氏菌引起小鼠眼炎的報道，其原因有待進一步研究。

肉眼或鏡下觀察出現病理變化的組織器官，通常是細菌的定植和入侵門戶[16-17，24-27]。沙門氏菌黏附到腸道黏膜后的內化途徑有2條：一條是通過巨胞飲的作用，侵襲動物腸黏膜淋巴結集結的淋巴上皮中的特殊抗原捕獲細胞——M細胞，通過M細胞進入黏膜下層組織；另一條是直接侵襲M細胞周圍的腸上皮細胞，通過上皮細胞進入黏膜下層組織[1]。腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌在進入消化道后，會在小腸和結腸繁殖并侵入黏膜下層組織[28-29]，牦牛源御成門沙門氏菌的入侵門戶為回腸[20]。該研究中羊源腸炎沙門氏菌經口進入消化道，能引起小腸粘膜淤血，十二指腸、空腸和回腸上皮細胞壞死，崩解，腸絨毛斷裂，因此這些部位可能就是其內化并向全身其他器官擴散蔓延的入侵門戶。

4 結論

山羊源腸炎沙門氏菌swun3816致病性強，經口服途徑接種可引起小鼠全身性感染，小腸是swun3816的入侵門戶。

參考文獻

[1]

陸承平.獸醫微生物學[M].5版.北京：中國農業出版社，2013：103-105.

[2] RAGHUNATHAN A，REED J，SHIN S，et al.Constraintbased analysis of metabolic capacity of Salmonella typhimurium during hostpathogen interaction[J].BMC Systems Biology，2009，3：38.

[3] MEAD P S，SLUTSKER L，DIETZ V，et al.Foodrelated illness and death in the United States[J].Emerging Infect Dis，1999，5（5）：607-625.

[4] TAUXE R V.Salmonella：A postmodern pathogen[J].Journal of food protection，1991，54（7）：563-568.

[5] LYNCH M F，TAUXE R V，HEDBERG C W.The growing burden of foodborne outbreaks due to contaminated fresh produce：Ricks and opportunities[J].Epidemiology and infection，2009，137（3）：307-315.

[6] 鄒惠英，劉麗紅，陳日炳，等.深圳市龍崗區沙門菌感染狀況研究[J].現代預防醫學，2014，41（7）：1293-1294，1303.

[7] European Food Safety Authority.European centre for disease prevention and control.The European union summary report on trends and sources of zoonoses，zoonotic agents and foodborne outbreaks in 2013 [J].EFSA Journal，2015，13（1）：3991.

[8] MIHAIU L，LAPUSAN A，TANASUICA R，et al.First study of Salmonella in meat in Romania[J].Journal of infection in developing countries，2014，8（1）：50-58.

[9] THAI T H，HIRAI T，LAN N T，et al.Antibiotic resistance profiles of Salmonella serovars isolated from retail pork and chicken meat in North Vietnam[J].International journal of food microbiology，2012，156（2）：147-151.

[10] 王晶晶，夏賓雁，岳華，等.四川省部分地區山羊沙門氏菌健康帶菌率及耐藥性調查[J].中國畜牧獸醫，2015，42（2）：472-477.

[11] SWEARINGEN M C，PORWOLLIK S，DESAI P T，et al.Virulence of 32 Salmonella strains in mice [J].PLoS One，2012，7（4）：1-5.

[12] PESCIAROLI M，ALOISIO F，AMMENDOLA S，et al.An attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium strain lacking the ZnuABC transporter induces protection in a mouse intestinal model of Salmonella infection[J].Vaccine，2011，29（9）：1783-1790.

[13] SUAR M，JANTSCH J，HAPFELMEIER S，et al.Virulence of broadand narrowhostrange Salmonella enterica serovars in the streptomycinpretreated mouse model[J].Infection and immunity，2006，74（1）：632-644.

[14] OHL M E，MILLER S I.Salmonella：A model for bacterial pathogenesis[J].Annu Rev Med，2001，52（1）：259-274.

[15] 曹恬雪，蔣文燦，何文成，等.沙門氏菌毒力因子的研究進展[J].中國預防獸醫學報，2014，36（4）：331-334.

[16] 孫衍慶，周捷，趙亞力，等.小鼠群暴發沙門氏菌病的病原學及病理學研究[J].中國生物制品學雜志，2002，15（1）：55-57.

[17] 朱曉霞.牦牛沙門氏菌分離鑒定方法及流行病學研究[D].成都：西南民族大學，2012.

[18] 呂靖.腸炎沙門氏菌SEF21和SEF14菌毛致病作用分析[D].揚州：揚州大學，2012.