“金艷”獼猴桃貯期腐爛病病原菌的分離鑒定

李可 李華佳 袁懷瑜 周艷 徐瑞 鐘楊 朱永清

摘要 [目的]明確“金艷”獼猴桃貯期腐爛病病原菌的種類。[方法]采用形態(tài)學及分子生物學方法對“金艷”獼猴桃貯期致腐微生物進行分離鑒定。[結(jié)果]與“金艷”獼猴桃貯藏期間腐爛相關(guān)的菌有 Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Eutypella microtheca、Penicillium expansum、Cladosporium cladosporioides共5種。其中對于Botrytis cinerea、 Sclerotinia sclerotiorum、Penicillium expansum 3種菌已有獼猴桃致腐的報道，Eutypella microtheca、Cladosporium cladosporioides 感染獼猴桃為首次報道。[結(jié)論]該研究為“金艷”獼猴桃采后腐爛病防治研究提供了科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞 “金艷”；獼猴桃；腐敗菌；分離；鑒定

中圖分類號 S609+.3文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0160-05

Abstract [Objective]To specify the spoilage bacteria species of “Jinyan”kiwifruit. [Method]The rot disease pathogens during storage of “Jinyan” kiwifruit were isolated and identificated.[Result]Five species of spoilage bacteria were identified as Botrytis cinerea， Sclerotinia sclerotiorum，Eutypella microtheca，Penicillium expansum，Cladosporium cladosporioides respectively. S. sclerotiorum，B. cinerea and P. expansum had been already reported in some other kiwifruit rot， while， E. microtheca and C. cladosporioides were the first reported in kiwifruit rot. [Conclusion] This study provided a scientific basis for the research on the prevention and control of rot for “Jinyan”kiwifruit after postharvest.

Key words “Jinyan”；Kiwifruit；Spoilage bacteria；Isolation；Identification

“金艷”獼猴桃是由中國科學院武漢植物園以毛花獼猴桃為母本，以中華獼猴桃為父本雜交選育的新品種[1]，果實為四倍體，果肉金黃色，肉質(zhì)細嫩多汁，風味清香，具有高產(chǎn)、晚熟、耐儲等優(yōu)良特性，是全球三大優(yōu)良黃肉獼猴桃品種之一[1-2]，深受廣大消費者的喜愛。四川省蒲江縣是“金艷”獼猴桃的故鄉(xiāng)，2010年蒲江獼猴桃被授予“地理標志保護產(chǎn)品”稱號，蒲江成為全球最大的優(yōu)質(zhì)黃肉獼猴桃產(chǎn)業(yè)基地，“金艷”獼猴桃也迅速成為四川省主栽獼猴桃品種之一，在當?shù)剞r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮主要支撐作用。隨著“金艷”獼猴桃產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴大，圍繞“金艷”獼猴桃的栽培、采收以及采后貯藏等相關(guān)研究也逐漸深入。王琪凱等[2]對“金艷”獼猴桃果實生長動態(tài)規(guī)律和貯藏性能進行了研究，為“金艷”獼猴桃的栽培管理、適時采收及果蔬貯藏等提供了理論依據(jù)；錢政江等[1]研究了采收期及低溫貯藏對“金艷”獼猴桃品質(zhì)的影響，為“金艷”獼猴桃采收期及采后貯藏方式的制定提供了理論參考；楊丹等[3]研究了貯藏溫度對采后“金艷”獼猴桃品質(zhì)和后熟的影響，為“金艷”獼猴桃商業(yè)化貯藏保鮮技術(shù)提供了參考。以上研究結(jié)果為“金艷”獼猴桃的商品化提供了技術(shù)支撐，但對導致“金艷”獼猴桃產(chǎn)生重大經(jīng)濟損失的貯期腐爛問題研究鮮有報道。

獼猴桃為漿果類水果，采后貯藏過程中極易受到微生物的侵染而腐爛，獼猴桃常見的微生物病害包括潰瘍病、腐爛病、根腐病及冠癭病等[4]，其中由真菌引起的霉腐爛病是導致貯期腐爛的最主要原因。段愛莉等[5]采用分子生物學方法研究確定了“海沃德”獼猴桃中致病菌種類有 Penicillium sp.CLF-S、 P.purpurogenum、 P.chrysogenum、 P.paneum和Trichoderma longibrachiatum ；龍明秀等[6]通過形態(tài)及分子生物學方法鑒定了“米良”獼猴桃中常見腐敗菌為 Myrothecium sp.、 Phoma sp.、 Alternaria sp.等；黎曉茜等[7]采用分子生物學方法確定了修文縣獼猴桃常見致病菌為 Pestalotiopsis gracilis ；李誠等[8]報道認為 Botryosphaeria dothidea、Botryotinia fuckeliana、Pestalotiopsis sp.、 Fusarium proliferatum、Phomopsis sp.、 Alternaria sp.等能引起獼猴桃果實腐爛。從以上研究結(jié)果可知，不同地區(qū)不同品種獼猴桃中常見微生物致病菌種類存在著較大的差異，這也是導致果蔬貯期防腐困難的關(guān)鍵所在。筆者采用分子生物學方法對“金艷”獼猴桃貯藏期間的腐敗菌進行分離鑒定，以期為“金艷”獼猴桃腐爛變質(zhì)防治措施的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“金艷”獼猴桃采摘自蒲江縣復興鄉(xiāng)陳壩社區(qū)。PDA培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），虎紅瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），YPD培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），PCR擴增試劑（日本TaKaRa公司），A.E.Z.N.A.TM DNA Kit Protocol（美國OMEGA公司）。

SGSP-02型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（恒豐醫(yī)療器械有限公司）；LDZX-75KB型全自動壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；T-1 Thermoblock PCR自動擴增儀（Biometra T-Gradient）；720BR 凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad Universal Hood II）；BHC-1300IIA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 腐爛病病原菌分離純化。將獼猴桃采收后置于1 ℃條件下貯藏70 d后放置在20 ℃貨架條件下7 d，選取霉變腐爛的果實作為微生物分離鑒定的材料。用無菌手術(shù)刀切取病變組織后，于70%乙醇中浸泡30 s后用無菌水沖洗3次，2%次氯酸鈉浸泡1 min，無菌水沖洗后，用接種針挑去感病部位后接種到PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)。采用劃線接種法對分離得到的菌落進行純化（虎紅瓊脂培養(yǎng)基），將純化后的單菌落接種至YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用于基因組DNA提取。

1.2.2 腐敗菌菌落形態(tài)觀察。將“1.2.1”純化后的菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 腐敗菌ITS序列PCR擴增及比對。菌株經(jīng)劃線純化后，選擇代表性菌株富集培養(yǎng)，離心，收集菌體。按照A.E.Z.N.A.TM DNA Kit Protocol提取總DNA，作為PCR擴增的模板，PCR反應體系（50 μL）：依次向200 μL EP管中加入33.75 μL dd H2O、5 μL 10×PCR緩沖液（Mg2+ Free）、3 μL MgCl2（25 mmol/L）、4 μL dNTP（2.5 mmol/L）上下游引物各1 μL，0.25 μL Taq 聚合酶（2.5 U/μL）、2 μL總DNA樣品，輕輕混勻后置于PCR儀中，PCR程序：95 ℃預變性9 min，然后95 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min完成35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

將上述ITS PCR產(chǎn)物測得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，從比對結(jié)果相同的序列中選取一個代表序列，與數(shù)據(jù)庫中已知菌ITS序列經(jīng)Clustal進行多重比對后，采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗果實表觀特征

隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和獼猴桃采后貯藏等技術(shù)水平的提高，實現(xiàn)了獼猴桃的周年化供應，但是在較長時期的貯藏過程中，獼猴桃由于在采收、分級和包裝過程中受到內(nèi)部或外部條件的影響而受到微生物浸染，出現(xiàn)嚴重的腐爛問題。對2015—2016年貯藏期間“金艷”獼猴桃調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，貯藏結(jié)束后“金艷”獼猴桃均發(fā)生了較為嚴重的微生物腐敗現(xiàn)象，同一貯藏周轉(zhuǎn)框中腐敗率最高在10%以上。

圖1、2顯示的是“金艷”獼猴桃感染微生物后的表觀特征及其果實內(nèi)部的變化，“金艷”獼猴桃感染部位多發(fā)生在獼猴桃果蒂部位及獼猴桃機械傷部位，果實莖端感染較多；病變部位表面附著的微生物菌落呈現(xiàn)出綠、灰和白3種顏色，其中菌落呈現(xiàn)白色的較多。微生物感染后由感染部位逐漸擴大，果皮顏色由淺黃色轉(zhuǎn)為棕褐色，果實手觸有水充盈感（圖1）。病變部位切開后果肉及果心均呈水浸狀（圖2），甜酸風味均變淡并伴有異味，致使獼猴桃喪失商品價值，造成嚴重的經(jīng)濟損失。

2.2 腐敗菌分離純化

該研究分離得到13株真菌，經(jīng)分離純化后得到5種菌落形態(tài)的真菌，各菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖3所示。

JY-1號菌在生長至第5天，菌絲鋪滿整個平面，菌落表面呈棉絮狀，略呈淺紅色或桃紅色，氣生菌絲較發(fā)達；JY-2號菌菌落中間呈青色，邊緣呈白色，背面呈黃色，菌落平鋪于平板，質(zhì)地致密；JY-3號菌菌落呈白色，菌落呈致密絲絨狀，菌落生長也較為緩慢；JY-4號菌菌落平鋪于平板，呈橄欖綠色，表面有褶皺，背面呈墨綠色，菌落呈致密短絨狀；JY-5菌菌落表面最初呈現(xiàn)白色，然后逐漸呈現(xiàn)灰白色，菌落表面呈致密絲絨狀，菌落生長較快。

2.3 腐敗菌總DNA提取及ITS rRNA序列PCR擴增

圖4和圖5分別顯示的是腐敗菌總DNA提取及ITS rRNA序列PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果，基因組DNA以DS15000為參照，ITS rRNA序列PCR產(chǎn)物以Trans2K plus 2DNA ladder為參照。由圖4可知，所提取總DNA序列長度均超過15 000 bp，且條帶清晰明亮，說明提取總DNA完整且濃度能夠滿足后續(xù)試驗要求。ITS rRNA 基因序列約為600 bp，由圖5可知，所獲得的18S rRNA序列PCR產(chǎn)物序列長度為600 bp左右，且條帶清晰明亮，表明該結(jié)果即為目的片段且濃度能夠達到后續(xù)測序要求。

2.4 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將所獲得的13個基因序列進行Clustal比對后，將相同的序列歸為一組，并從中選取代表序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)比對結(jié)果，共篩選出5個不同的ITS基因序列，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，與數(shù)據(jù)庫中已知菌序列進行比對，選取數(shù)據(jù)庫中相似度較高的序列與代表序列經(jīng)多重比對后，采用MEGA 5.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，分離的5株菌聚為4個分支，JY-3與JY-5聚為1支，但JY-3與 Botrytis sp.1 S58、 Botrytis cinerea BCM13704、 Botryotinia fuckeliana RSL-1等具有較高的相似度（99%），JY-5與 Sclerotinia sclerotiorum wb560、 Botryotinia fuckeliana Bot.1284、 Botrytis cinerea G409等具有較高的相似度，結(jié)合菌落形態(tài)可知，JY-3菌株為 Botrytis cinerea ，JY-5為 Sclerotinia sclerotiorum 。同樣地，JY-1、JY-2、JY-4依次被鑒定為 Eutypella microtheca、Penicillium expansum、Cladosporium cladosporioides。

3 結(jié)論與討論

微生物致腐是獼猴桃采后果實腐爛的最主要原因，在果園掛果期間微生物感染會導致獼猴桃爛果落果，在貯藏期間主要表現(xiàn)為爛果，且由于貯藏期間獼猴桃放置較集中，微生物侵染會更迅速，這將對獼猴桃產(chǎn)量、品質(zhì)和貯藏期產(chǎn)生較大影響，其損失也會更加嚴重。果蔬采后腐爛主要來自病原菌采前潛伏感染和采后感染，潛伏感染即果蔬在采前已受到多種病原菌的侵染，而病原菌的病害在貯藏期間表現(xiàn)出來。采后感染主要是在果實采收、分裝、運輸、銷售過程中造成機械傷而侵染微生物導致腐爛。微生物侵染果實的途徑有3種：①通過果實表面的氣孔、皮孔、果蒂等部位侵染；②通過表面?zhèn)谇秩荆虎圩陨矸置诩闹骷毎谒饷傅任镔|(zhì)直接侵染。病原菌侵染后可通過產(chǎn)生多種酶甚至毒素破壞果實細胞結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)導致果實腐爛，也可誘導激發(fā)果實組織形態(tài)和生理、分子水平變化，加速果實軟化衰老進程，縮短果實貯藏期[9-10]。通過對2015—2016年“金艷”獼猴桃真菌腐爛現(xiàn)象研究發(fā)現(xiàn)，“金艷”獼猴桃真菌腐爛多發(fā)生在果蒂部位及機械傷部位，微生物侵染后主要表現(xiàn)為獼猴桃的快速軟化、果肉水浸狀，果汁外溢并伴有異味。分析其原因，多數(shù)是采前潛伏菌在果蒂部位及機械傷部位引發(fā)感染所致。因此，減少采后機械傷、提高愈傷效率、保證愈傷完全能有效減少采后果實腐爛現(xiàn)象。

近年來，對于獼猴桃腐敗病原菌的研究已成為獼猴桃采后研究的熱點。李誠等[8]、丁愛冬等[11]研究認為， Phomopsis sp.、 Botryotinia fuckeliana、Alternaria alternata、Btryosphaeria dothidea和Fusarium proliferatum 等是引起獼猴桃采后果實腐爛的主要真菌；江峰等[12]從腐爛獼猴桃中分離到淺黃色隱球酵母菌、青霉菌、茁芽短梗霉菌、中華根霉菌共4種致病菌。該研究從蒲江縣廣泛種植的“金艷”獼猴桃中分離得到5種微生物，分別被鑒定為 Botrytis cinerea、Sclerotinia sclerotiorum、Eutypella microtheca、Penicillium expansum、Cladosporium cladosporioides。其中Botrytis cinerea 是導致多種獼猴桃灰霉病最常見的腐敗微生物，主要通過果蒂部位侵染并逐步擴展至全果，初期表現(xiàn)為白色至灰色霉層，最后形成不規(guī)則的黑色菌核[13]。該菌侵染后可促使低溫貯藏下的獼猴桃產(chǎn)生少量乙烯，加速獼猴桃的熟化，縮短其貯藏期并具有較強的傳染能力[14]；湯麗梅等[15]、李誠等[8]分別報道了該菌的生物、化學防治方法。 Sclerotinia sclerotiorum 是一種較高侵染性病原菌，可感染多種經(jīng)濟作物如油菜、苜蓿、大豆、豌豆、向日葵等，該菌具有較強的生命力，在不利的生長條件下形成菌核，感染植物后能形成白色的菌絲覆蓋在植物表面；Lee等[4]在2015年首次發(fā)現(xiàn)該菌具有獼猴桃侵染能力，主要表現(xiàn)為軟化、果肉水浸狀并在表面形成白色菌絲，其防治方法有待于進一步研究。 Penicillium expansum 為柑橘[16]、蘋果[17]等常見的果蔬腐敗微生物，對于其生物及化學防治方法已有較深入的研究[18]。 Eutypella microtheca 是一種葡萄樹干潰瘍病致病菌[19]，感染的植株會出現(xiàn)潰瘍面甚至死亡，但尚未見侵染獼猴桃的報道。 Cladosporium cladosporioides 又叫黃瓜黑星病菌，枝孢屬（ Cladosporium ）真菌的一種，是植物地上部分的寄生菌，具有較為廣泛的植物侵染性[20-22]。 Cladosporium cladosporioides 多見于植物葉片部位感染，在病變部位形成橄欖綠色霉層，葉基和葉柄部位形成灰褐色霉層，該菌感染后病害發(fā)展較緩慢、死亡率低且較易防治，目前尚未見獼猴桃果實感染的報道，有關(guān)其致病性、致病規(guī)律及防治有待進一步研究[22]。

該研究從腐爛的“金艷”獼猴桃中分離得到5種菌，有些菌種在其他品種獼猴桃中也有相關(guān)報道，但有些屬于首次報道。通過以上研究結(jié)果可知，不同品種獼猴桃主要致病菌種類也不盡相同，獼猴桃致病菌的分離鑒定是獼猴桃采后微生物病害科學防治研究的前提與基礎。同時，不同致病菌侵染途徑也不相同，淺黃色隱球酵母菌、青霉菌、茁芽短梗霉菌、中華根霉菌等主要是通過傷口侵染獼猴桃[12]， Botryotinia fuckeliana 等則可通過果蒂部位直接侵染[13]。該研究分析了“金艷”獼猴桃采后致病菌的種類及其可能的感染途徑，為其腐爛病的防治研究提供了科學依據(jù)與參考。

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