懸鉤子屬野生種和栽培種資源SSR引物篩選與評價

耿佳麒，王宇航，雷蕾，孫海悅，周強，唐雪東，梁英海

摘要 [目的]分析懸鉤子屬植物的遺傳多樣性，研究現存懸鉤子SSR引物的通用性。[方法]通過簡單重復序列標記（SSR）用12份懸鉤子屬野生和栽培種類資源對40對引物進行篩選。[結果]共篩選出8對引物對全部12個樣品擴增良好，多態性比率為100%，可用于遺傳多樣性的分析。[結論]該試驗篩選的8對引物可為下一步研究提供依據。

關鍵詞 懸鉤子；SSR引物；篩選；評價

中圖分類號 S663.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0083-04

Screening and Evaluation of SSR Primers in Wild and Cultivated Species of Rubus L.

GENG Jiaqi，WANG Yuhang，LEI Lei et al （Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118）

Abstract [Objective]To analyze the genetic diversity of Rubus L. and study the universality of the existing SSR primers of Rubus L.. [Method]Forty pairs of primers were screened from 12 wild and cultivated species of Rubus L.by simple repeated sequence marker （SSR）. [Result]8 pairs of primers were screened and amplified all 12 samples with a polymorphism ratio of 100%， which could be used for genetic diversity analysis. [Conclusion]The 8 pairs of primers in this experiment can provide the basis for further study.

Key words Rubus L.；SSR primers；Screening；Evaluation

懸鉤子（Rubus L.）是多年生落葉灌木植物[1]，種類豐富，雜合度高，在寒帶及溫帶地區均有分布。在我國，懸鉤子屬植物有150個種以上[2]。懸鉤子屬栽培品種具有較高的經濟價值和藥用價值，其果實可用于鮮食、加工和醫用[3-4]。

隨著果樹分子生物技術快速發展，國內外學者在形態學、孢粉學、細胞學以及同工酶鑒定研究基礎上，加大了對懸鉤子屬植物資源分子水平的研究[4]，應用分子標記分析了懸鉤子屬植物的遺傳多樣性[5]。目前，已有利用SSR和RAPD分子標記分析懸鉤子栽培種資源遺傳多樣性的報道[6]，但對懸鉤子野生種資源的研究較少。

懸鉤子屬樹莓屬于第三代新興小漿果[7]。在農業供給側結構性改革和生態建設背景下，有必要對我國蘊藏的大量懸鉤子野生資源進行有效收集評價和開發利用，其遺傳多樣性研究是重要的基礎工作。由于懸鉤子屬植物類型多樣，雜合度高，可應用SSR分子標記開展相關研究。目前，懸鉤子屬植物SSR引物主要為蘇格蘭詹姆斯·赫頓研究所（http：//www.hutton.ac.uk/）以及Graham等[8]所開發引物，這些引物是否適用于我國野生懸鉤子資源鮮見報道。該研究旨在篩選評價Graham等所開發引物，以供國內相關研究參考，并考察相同SSR引物在不同地緣分布資源間的通用性問題，以提出懸鉤子屬植物分子水平資源研究建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。植物材料有茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、牛迭肚、綠葉懸鉤子、黃樹莓、黑樹莓、歐洲莓、奧瑞斯8份資源，以及于2016年于蛟河采集的野生資源牛迭肚（J-1-3）、牛迭肚（J-1-4）、牛迭肚（J-2-1）、牛迭肚（J-2-2）4份，共12份材料（表1）。取上述材料嫩葉，供提取基因組DNA。

1.1.2 藥品。CTAB、Tris堿、氯化鈉、氫氧化鈉、β-巰基乙醇、無水乙醇、三氯甲烷、異戊醇、瓊脂糖、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、rTaq預混酶、超純水。試驗藥品購于TaKaRa公司。

1.1.3 引物。SSR引物為Graham等[8]開發的30對引物和詹姆斯·赫頓研究所開發的10對引物，SSR引物由金唯智公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測。供試材料在液氮中研磨至粉末狀，加入離心管中，采用CTAB法[9]提取12份樣品的DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA質量，用超微量分光光度計檢測DNA濃度與純度，將條帶清晰、質量良好的DNA稀釋至20 ng/μL，-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 SSR-PCR擴增。PCR所采用的體系是經過優化的最適體系，退火溫度為55 ℃。采用20 μL反應體系：ddH2O 11.2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，模板DNA（DNA濃度為20 ng/μL）3 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/L）0.2 μL，dNTP（10 mmol/L）1.2 μL，10×Buffer（含Mg2+）2 μL。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

1.2.3 PCR產物檢測。

1.2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增結果，將擴增出的條帶清晰且多態性好的引物進行下一步聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測。

1.2.3.2 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。①清洗，用洗滌劑清洗玻璃板后蒸餾水沖洗干凈，用無水乙醇清潔后晾干備用；②注膠，安裝好玻璃板后，將1%瓊脂糖凝膠注入玻璃板底部，密封玻璃板，注意不要有氣泡；待膠凝固后，將配制好的聚丙烯酰胺凝膠定點緩慢注入玻璃板空隙（注入過程應盡量避免氣泡的產生），插入齒梳，避免齒梳周圍產生氣泡，靜置50～60 min待凝膠凝固；③預電泳，凝膠凝固后，小心拔出齒梳，用電泳液沖洗膠孔；玻璃板內槽加滿1×TBE緩沖液，外槽緩沖液加至1/3體積即可，設置電壓350 V，電流500 mA，預電泳60 min；④上樣，按照樣品∶上樣緩沖液=10∶3比例混合，待預電泳結束后進行上樣，電壓240 V，電流500 mA，電泳90 min。

1.2.3.3 銀染。電泳結束后，取下凹型玻璃板，將凝膠留在平板玻璃上。①清洗，清水沖洗膠面30 s，蒸餾水沖洗膠面30 s；②固定，固定液沒過膠面，搖10～20 min；③洗膠，蒸餾水沖洗膠面2 min，沖洗2次，傾斜玻璃板瀝水；④染色，硝酸銀染色液沒過膠面，搖6 min；⑤洗膠，蒸餾水沖洗凝膠10 s左右，沖洗2次，取出膠板，瀝干；⑥顯色，將膠板浸于提前預冷的500 mL顯色液中，搖床搖至所有條帶出現，即停止顯色；⑦洗膠，蒸餾水沖洗膠板2 min；⑧固定，膠板完全浸于固定液，固定10 min，清洗干凈后，瀝干水再進行拍照和后續數據分析。

1.3 統計分析 根據聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶片段大小和SSR特異性條帶特點，使用GEL-PRO軟件，將同一引物相同片段大小SSR特異條帶計為1，無條帶記為0，擴增不良或非特異性條帶不計入其中，形成0-1矩陣，并用Popgene 32軟件，分析多態性位點百分比（PPB）、有效等位基因數（Ne）、Neis指數（h）、Shannon指數（I）。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選結果 利用40對（表2）SSR引物對12份供試材料進行SSR-PCR擴增，經電泳檢測，共有8對SSR引物在12份資源中擴增出差異性強和多態性良好的產物（表2、圖1、圖2），分別為Rubus25a、Rubus110a、Rubus117a、Rubus119a、Rubus166b、Rubus167a、Rubus233a、Neb1G02，占總引物數的20%，多態性百分率為100%，這些引物可以在野生種和栽培種中擴增出條帶。Rubus123a、Rubus194h、Neb1A10、Neb1J15、Neb1k24引物，僅在茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、綠葉懸鉤子中成功擴增出條帶，但是對于牛迭肚懸鉤子擴增效果較差（圖3、4）。

2.2 引物多態性分析 所篩選出的8對引物共擴增出142條帶，平均每個引物擴增出17.75條帶。根據目的條帶大小統計，每個引物最多擴增出2個位點，引物Rubus110a檢測出的條帶最多為18條，Rubus25a檢測出的條帶最少為12條。全部引物的目的片段均為100～250 bp，所統計的條帶數目均在目的條帶上下，片段大小差異不大。

2.3 SSR位點分析 應用Popgene32軟件分析8對SSR引物擴增獲得的0-1矩陣數據，表明每個位點的有效等位基因數（Ne）在1.600 0～1.976 7，平均等位基因數為1.766 6。Neis基因多樣性指數（h）分布在0.267 2～0.494 0，平均每個位點的Neis指數為0.399 8。所得到的Shannon指數（I）為0.417 0～0.687 1，平均值為0.579 1（表3）。

3 討論與結論

3.1 懸鉤子屬植物資源有待評價開發利用 我國大小興安嶺、長白山等地區蘊藏豐富的懸鉤子屬資源，但由于全球氣候變化和人為活動頻繁，樹莓資源正在嚴重流失，需要有針對性開展資源收集評價與開發利用工作，而利用分子標記技術開展分子水平資源研究具有重要意義。Graham 所開發的SSR引物在國內外相關研究中應用廣泛，用于遺傳多樣性[10]、親緣關系[11]、遺傳圖譜構建[8，12]，但國外多數研究集中于栽培品種（品系），甚至只給出引物出處，未明確指明引物名稱或序列，給相關研究帶來被動局面；國內學者也應用這些引物開展相關分子標記研究[13]，亦主要研究樹莓栽培資源。該研究針對上述情況，評價篩選出8對SSR引物用于茅莓懸鉤子、庫頁懸鉤子、綠葉懸鉤子、牛迭肚等資源SSR-PCR擴增，可為相關資源分子水平評價提供重要數據參考。

3.2 懸鉤子屬植物SSR引物通用性及開發利用 該研究考察了Graham等利用國外資源開發的引物在我國野生和栽培種中的通用性問題，在選用的40對SSR引物中僅篩選出8對引物用于全部供試材料，表明了不同地理分布栽培資源間，尤其栽培與野生資源間存在引物通用性，也表明了懸鉤子屬植物SSR序列進化保守性。

目前，SSR分子標記技術已廣泛用于果樹遺傳多樣性、親緣關系和遺傳圖譜構建研究[14-17]，應用價值較高。由于該研究僅在7個栽培和野生種共計12份資源上評價了供試引物，且僅獲得8對可在全部材料成功擴增的引物，在引物數量和資源針對性上，不能滿足未來對豐富懸鉤子屬資源收集保存評價利用工作的需要。在組學和大數據時代[2，18-20]，可利用新方法新技術，針對我國懸鉤子屬植物資源，開發利用分子標記，尤其是功能分子標記[20]，支撐和促進樹莓等小漿果產業發展。

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