湖羊GDF9基因多態性和產羔性能的關系

顧祝榮，郭海燕，王強，李擁軍，瞿靜雯，楊媛

摘要 [目的]研究湖羊GDF9基因多態性和產羔性能的關系。[方法]以湖羊為試驗對象，對湖羊GDF9基因做PCR-SSCP多態性檢測，分析多態性對湖羊產羔性能的影響。[結果]檢測出3種基因型，定義為GG、AG、AA。基因型測序顯示，在152 bp處發生了A被G堿基替換而發生突變。GG基因型頻率、AG基因型頻率和AA基因型頻率分別為0.107、0.883和0.010。湖羊GG、AG和AA基因型的第1，2胎平均產羔數分別為2.068、2.025和1.500。3種基因型對第1胎產羔數沒有影響；第2胎產羔數GG、AG與AA之間有顯著性差異，表明GDF9基因對湖羊第2胎產羔數有影響。從第1、2胎的平均產羔數來看，差異不顯著，但GG和AG基因型的產羔數相對AA基因型較高。[結論]GDF9基因對綿羊正常的繁殖是必需的，且該基因對湖羊產羔數有一定影響。

關鍵詞 湖羊；GDF9基因；PCR-SSCP；產羔數

中圖分類號 S826 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0087-03

The Relationship between GDF9 Gene Polymorphism and Lambing Performance in the Hu Sheep

GU Zhurong，GUO Haiyan ，WANG Qiang et al （Animal Science and Technology College，Yangzhou University，Key Laboratory for Animal Genetic，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract [Objective]To study the relationship between GDF9 gene polymorphism and lambing performance in the Hu sheep.[Method]Hu sheep's GDF9 gene polymorphism was detected by PCRSSCP.The effect of polymorphism on the lambing performance of Hu sheep was analyzed.[Result] Three genotypes were detected and defined as GG，AG，AA.Genotype sequencing showed that the base A was replaced by base G at 152bp.GG genotype frequency，AG genotype frequency and AA genotype frequency were calculated， and the results were 0.107，0.883 and 0.010.The average number of two litters of GG，AG，AA genotypes were 2.068，2.025 and 1.500，respectively.The three genotypes had no effect on the first litter size.There was significant difference between GG，AG and AA in second litter and the GDF9 gene had an effect on the second litter size.From the average number of two litters，the results of variance analysis were not significant，but it also could be seen from the date that the number of litter size of GG and AG genotypes was relatively higher than litter size of AA genotypes.[Conclusion]GDF9 gene is necessary for normal breeding of sheep，and it has a certain effect on the litter size of Hu sheep.

Key words Hu sheep；GDF9 gene； PCRSSCP；Litter size

我國綿羊產業相對發達，綿羊業高產的原因之一便是其產羔的多胎性，其中湖羊的產羔性狀較優，平均每年可產1～2胎，每胎產羔2～3只，有最高1胎產5只的記載[1-4]。湖羊的繁殖性狀是由多種基因共同調控的數量性狀，育種時較難對這一類性狀進行有效的控制。隨著現代科學技術的發展，人們可以利用分子標記、PCR擴增、DNA測序等技術對湖羊繁殖性狀起主要作用的基因進行研究。

生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）被歸類為TGFβ（transforming growth factor β ）超家族成員，也有學者稱其為FecG基因，在卵母細胞分泌的眾多生長因子中，它是首個被發現并相繼被許多學者研究的對象[5-8]。其在人和綿羊上定位于5號染色體，在牛上定位于7號染色體，在小鼠上定位于11號染色體，在大鼠上定位于10號染色體，可編碼400多個氨基酸[9-10]，對早期卵泡的生長發育有明顯的調節作用[11]。對湖羊和負鼠的研究發現，GDF9基因在子宮、輸卵管、卵巢等繁殖相關組織中均有較高表達，產仔數高的卵巢mRNA表達水平也較產仔數少的顯著，說明GDF9基因與卵泡形成及高繁殖力性狀間聯系密切[12-14]。對 GDF9基因的突變位點進行檢測，分別有學者發現在1 184 bp有C→T的突變，在729 bp有G→T的突變，在152 bp有A→G的突變，在790 bp有C→A的突變，分析發現多種突變對母羊的排卵數都有顯著的促進作用[15-17]。還有研究顯示，GDF9基因的2個突變可以顯著提高宗地花豬的產仔數、產活仔數以及仔豬初生重[18]。殷昆侖等[19]對GDF9基因在不同品系小鼠中的多態性分析時，第1次發現BALB/c和ICR 這2種小鼠GDF9基因的5′ UTR和所編碼的蛋白成熟區位點存在多態性，判斷GDF9基因與小鼠的繁殖力密切相關。顏泉梅等[20]也在對西農奶山羊和波爾山羊的研究時發現GDF9基因存在多態性，且產仔數AA基因型極顯著高于AG、GG基因型，顯然GDF9基因對研究對象的產羔性能存在著未知的必然影響。許多研究都證實了GDF9基因是動物高產仔數的主要作用基因之一。

筆者對湖羊GDF9基因進行多態性檢測，并分析多態性對湖羊產羔性能的影響，為湖羊品種的選育工作提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集 供度樣品來自江蘇漣水縣紅業山羊養殖專業合作社，選取已有2胎生產記錄的206只湖羊。分批次對206只湖羊進行頸靜脈采血，每只采集血液3 mL左右，并相應記錄其耳標號。用一次性采血盛血器采血，每次采血前在一次性采血盛血器中加入ACD抗凝劑。將采集的血樣暫時存放冰盒內運輸，后放在4 ℃環境下保存，提取DNA。

1.2 血樣DNA提取 DNA提取方法參照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒說明書，提取的DNA在-20 ℃環境下保存。

1.3 引物設計和PCR擴增、酶切及檢測 根據Bodensteiner等[13]報道的綿羊GDF9基因全序設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為上游引物： 5′-TTGTAGCTAGGACTGCGTTGG-3′；下游引物： 5′-GCCTTATAGAGCCTCTTCATGT-3′。

PCR反應體系為25 μL，其中血樣提取物1 μg，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×12.5 μL Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，再用ddH2O補至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性60 s，引物57 ℃復性90 s，72 ℃延伸60 s，34個循環；72 ℃終延伸7 min。產物用3%的瓊脂糖凝膠檢測，4 ℃環境下保存。

1.4 SSCP多態性檢測 取PCR產物2 μL和上樣緩沖液[98%甲酰胺、10%甘油、0.025%溴酚藍、10 mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025%二甲苯青]5 μL于PCR管內，98 ℃變性10 min后迅速放入冰中5 min，可保持其變性狀態。在14%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）中進行電泳檢測，結束后用銀染法顯帶。

1.5 DNA測序 將提取的血樣DNA樣本送到無錫翼和應用生物技術有限公司進行DNA測序及基因型鑒定，對所得數據進行整理和結果分析。

1.6 數據統計及分析 收集整理試驗樣本（湖羊）的生產記錄，計算湖羊GDF9不同基因型及基因型頻率。用SPSS 22.0軟件處理數據，對不同GDF9基因型的湖羊產羔數進行Duncan方差分析，比較不同基因型與產羔數之間的關系。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果 將湖羊基因組用設計好的引物進行PCR擴增，對PCR產物再進行瓊脂糖（3%）凝膠電泳檢測，結果表明（圖1）：目的條帶為162 bp左右，其大小符合預期，特異性良好，能直接進行下一步SSCP分析。

2.2 SSCP檢測結果 用引物的PCR擴增產物做SSCP檢測，結果表明（圖2）：擴增產物出現了3種基因型，判定GDF9基因在此次試驗中存在多態性，將這3種基因型定義為GG、AG和AA型。從圖中看出GG基因型泳道是8、9、10；AG基因型泳道是1、2、3、4；AA基因型的泳道是5、6、7。

2.3 湖羊GDF9基因及基因型測定結果 經生物公司測定，送檢湖羊樣本的GDF9基因存在多態性，共有3種基因型，將其分別定義為GG、AG、AA型。206個有效樣本中有22個為GG基因型，182個為AG基因型，2個為AA基因型。計算GG基因型頻率、AG基因型頻率和AA基因型頻率，結果分別為0.107、0.883和0.010，等位基因G的頻率為0.917，等位基因A的頻率為0.083。GG、AG和AA基因型第1、2胎的平均產羔數分別為2.068、2.025和1.500。

2.4 GDF9基因不同基因型測序結果 為確定GDF9基因的突變位點，將3種基因型的PCR產物送公司測序，測序結果表明（圖3）：在152 bp處發生了A→G的突變（A152G）。

2.5 湖羊GDF9基因不同基因型頻率及產羔數 GDF9基因不同基因型湖羊產羔數見表1。湖羊GG、AG、AA這3種基因型第1胎產羔數和第1、2胎平均產羔數均為差異不顯著（P>0.05）。第2胎的分析結果為GG、AG與AA基因型產羔數差異顯著（P<0.05），而GG與AG基因型產羔數差異不顯著（P>0.05），從數據中可以看出，GG和AG基因型的產羔數相對AA基因型較高。

3 討論與結論

繁殖育種學家在很早以前便廣泛關注了羊的多胎性，對可能與這一性狀相關的基因也進行了分子水平上的研究。2004年，國外學者曾經對Belclare和Cambridge這2個綿羊品種GDF9基因進行研究，發現在這2種綿羊染色體上都發生了突變，并且發現GDF9基因突變的方式與BMP15失活突變十分類似。進一步分析結果表明：攜帶純合子的母羊表現不育，而攜帶雜合子的母羊排卵數明顯提高。此次研究說明GDF9基因對綿羊正常的繁殖是必需的[15]。李碧俠等[16]在陶賽特、湖羊、薩福克綿羊這3個品種中都發現了GDF9基因的cDNA第152 bp處有A→G的轉換，但在湖羊中只檢測到雜合子，而對研究的基因和產羔率之間的相互關系并未闡述。周澤曉等[17]在貴州山羊GDF9基因多態性與產羔數相關性研究中，檢測到外顯子2的790 bp處存在突變而導致的多態性，認為此基因對貴州白山羊的繁殖力有影響，且推測與綿羊繁殖性能的方式相似。許多學者的研究都表示GDF9基因與動物的繁殖性能有很大的聯系，但也有些學者得到了相反的結果，路立里等[21]在對哈薩克羊GDF9基因的PCR-RFLP多態性研究時就沒有發現此基因存在多種基因型，GDF9基因對哈薩克羊的繁殖性能沒有調控作用。吳麗麗等[22]也曾對湖羊GDF9基因進行研究，結果表明GDF9基因與湖羊的多胎性狀沒有相互關系。

該試驗的樣本數為206個，結果顯示湖羊GDF9基因存在多態性（GG、AG和AA），GG基因型頻率為0.107，AG基因型頻率為0.883，AA基因型頻率為0.010。對產羔數關系的分析結果顯示，3種基因型對第1胎產羔數沒有顯著性影響，這可能與湖羊第1胎產羔數的不穩定性有關系。第2胎GG、AG與AA之間有顯著性差異，表明GDF9基因對湖羊的產羔數有影響，試驗結果有一定的參考價值。此次試驗樣本太少，供試湖羊全部來自一個羊場，未經選育，只有第1胎和第2胎的生產數據，對試驗結果有一定的影響。從第1、2胎的平均產羔數來看，雖然差異不顯著，但GG和AG基因型的產羔數相對AA基因型是比較高的，結合第2胎產羔數的分析結果，筆者認為GDF9基因對湖羊的多胎性存在一定的影響。如果要進一步分析GDF9基因對湖羊產羔性能的影響，需要增加樣本的檢測數量和采集地點，獲得更多的產羔胎次數，并聯合多個基因來進一步分析GDF9和湖羊產羔數的相互關系。

參考文獻

[1] 張居農.高效養羊綜合配套新技術[M].2版.北京：中國農業出版社，2001.

[2] 鄭軍，林嘉.湖羊生產技術[M].北京：金盾出版社，2002.

[3] 《中國農畜家禽品種志》編委會，《中國羊品種志》編寫組.中國羊品種志[M].上海：上海科學技術出版社，1989.

[4] 孫偉，常洪，張明，等.湖羊產羔性狀可能生產力估計[J].江蘇農業科學，2008（1）：173-175.

[5] YOSHIDA M，CRAN D G，PURSEL V G.Confocal and fluorescence microscopic study using lectins of the distribution of cortical granules during the maturation and fertilization of pig oocytes[J].Molecular reproduction & development，1993，36（4）：462-468.

[6] VITT U A，HSUEH A J W.Stagedependent role of growth differentiation factor9 in ovarian follicle development[J].Molecular & cellular endocrinology，2002，186（2）：211-217.

[7] 彭中友，孫俊銘，李燕，等.GDF9和FST調控豬卵母細胞成熟和胚胎早期發育[J].江蘇農業學報，2015，31（3）：583-589.

[8] CLELLAND E S，KELLY S P.Exogenous GDF9 but not Activin A，BMP15 or TGFβ alters tight junction protein transcript abundance in zebrafish ovarian follicles[J].General & comparative endocrinology，2011，171（2）：211-217.

[9] 吳澤輝，儲明星，李學偉.生長分化因子9基因及其在生殖中的作用[J].遺傳，2005，27（3）：481-486.

[10] SADIGHI M，BODENSTEINER K J，BEATTIE A E，et al.Genetic mapping of ovine growth differentiation factor 9 （GDF9） to sheep chromosome 5[J].Animal genetics，2002，33（3）：244-245.

[11] 管峰，艾君濤，龐訓勝，等.綿羊GDF9和BMP15基因多態性檢測[J].生命科學研究，2005，9（2）：184-188.

[12] 胡冬利，李齊發，徐業芬，等.湖羊生長分化因子9（GDF9）基因組織表達特征、mRNA表達水平與SNPs分析[J].農業生物技術學報，2010，18（3）：533-538.

[13] BODENSTEINER K J，CLAY C M，MOELLER C L，et al.Molecular cloning of the ovine Growth/Differentiation factor9 gene and expression of growth/differentiation factor9 in ovine and bovine ovaries[J].Biology of reproduction，1999，60（2）：381-386.

[14] ECKERY D C，WHALE L J，LAWRENCE S B，et al.Expression of mRNA encoding growth differentiation factor 9 and bone morphogenetic protein 15 during follicular formation and growth in a marsupial，the brushtail possum （Trichosurus vulpecula）[J].Molecular & cellular endocrinology，2002，192（1/2）：115-126.

[15] HANRAHAN J P，GREGAN S M，MULSANT P，et al.Mutations in the genes for oocytederived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep （Ovis aries）[J].Biology of reproduction，2004，70（4）：900-909.

[16] 李碧俠，儲明星，王金玉.綿羊GDF9基因PCR-SSCP分析[J].遺傳學報，2003，30（4）：307-310.

[17] 周澤曉，王嘉福，冉雪琴.貴州白山羊GDF9和BMP15基因多態性與產羔數的相關性研究[J].中國畜牧雜志，2012，48（21）：9-14.

[18] 林鵬飛，任麗群，李平，等.宗地花豬BMPR-IB基因多態性與繁殖性狀的關聯性[J].江蘇農業科學，2017，45（17）：35-38.

[19] 殷昆侖，張長勇，王天奇，等.GDF-9和BMP-15在不同品系小鼠中的多態性和生殖能力關聯分析[J].中國比較醫學雜志，2013，23（3）：8-13.

[20] 顏泉梅，楊莎，朱廣琴，等.西農莎能奶山羊和波爾山羊GDF9基因多態性與產羔數的相關分析[J].中國獸醫學報，2010，30（10）：1394-1397.

[21] 路立里，韓冰，陳春華，等.哈薩克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因的PCR-RFLP多態性研究[J].中國草食動物科學，2017，37（5）：6-9.

[22] 吳麗麗，趙曉楓，張立凡，等.湖羊BMPR-IB、BMP15和GDF9基因的RFLP分析[J].中國草食動物科學，2011，31（4）：9-12.