茉莉花JsPAL2基因的克隆與表達分析

熊青 宋姣敏 崔萌 許穎妍 俞瀅 葉乃興 陳桂信

摘 要 為了研究茉莉花花香代謝相關分子機制，本研究基于茉莉花轉錄組測序結果，采用PCR技術從雙瓣茉莉花花瓣的cDNA文庫中克隆出苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的全長cDNA，命名為JsPAL2。該cDNA的全長為2 181 bp，其中ORF為2 079 bp，編碼693個氨基酸的蛋白，分子量為75 599.19 u。序列分析結果表明，該基因編碼的氨基酸序列與油橄欖（Olea europaea ）的PAL具有82%的同源性。利用100 μmol/L的外源激素茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）噴施成熟花苞，并采用熒光定量PCR技術檢測JsPAL2在茉莉花發育過程、開放過程以及經MeJA處理過后花朵中的表達量變化。結果表明，在花蕾生長發育時期，JsPAL2的表達量隨著天數的增加而升高，在5 d時達到最高；在不同開放時期，18：00花朵未開放時JsPAL2表達量最低，22：00花朵半開放時表達量最高；經外源茉莉酸甲酯處理后，JsPAL2的表達量明顯增加，在處理后7 h達到最高，隨后逐漸降低，推測該基因可能與茉莉花香氣物質的合成有關，同時MeJA可能對其表達有誘導的作用。

關鍵詞 茉莉花；PAL基因；生物信息學；茉莉酸甲酯；熒光定量PCR

中圖分類號 S31 文獻標識碼 A

Abstract To explore the mechanism of fragrance metabolism in Jasminum sambac， the full-length of cDNA of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） named JsPAL2 was cloned from the petals. Results showed that the full-length of the cDNA was 2 181 bp， including an ORF of 2 079 bp， encoding 693 amino acids with 75 599.19 u molecular weight. The results of alignment of amino acids had a homology of 82% to that of olive （Olea europaea ）. Exogenous hormone methyl jasmonate with concentrate at 100 μmol/L was used to spray mature buds， fluorescent quantitative PCR was used to detect the change of gene expression in the process of growth and development， openning time and treatment of MeJA of flower. Results showed that the expression of JsPAL2 rised as days increased during growth and development period， reaching the top at 5 d； during openning time， the expression of JsPAL2 was minimum at 18：00 when flower was not open， reaching to maximum at 22：00 when the flower was half opennin： after the treatment of MeJA， the expression of JsPAL2 had an obvious increase， reaching the top in 7 h， and then reduced gradually.

Keywords Jasminum sambac； PAL gene； bioinformatics； methyl jasmonate； fluorescent quantitative PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.015

茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]是木犀科茉莉屬香料植物，屬典型的氣質花[1]，但只在夜晚開花吐香，其獨特的花香使之成為窨制花茶和香料提取的重要原材料。植物產生花香的物質通常有萜類、苯丙烷類和脂肪酸等，主要通過萜類代謝途徑、苯丙烷類代謝途徑、酯類代謝途徑和脂肪酸代謝途徑調控合成。茉莉花的香氣物質中烯類化合物、苯丙烷類物質釋放量最大，其中苯甲酸甲酯、水楊酸、水楊酸甲酯、甲基丁子香酚等主要香氣物質可通過苯丙烷類代謝途徑調控合成[2]。

PAL是連接生物初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的關鍵限速酶，催化苯丙氨酸形成肉桂酸，促進植物芳香物質生成[3]，對茉莉花苯丙烷類香氣物質形成具有重要作用。1961年，Koukol等[4]首次從大麥中發現了PAL酶，并進行了分離純化。此后，隨著分子生物學和基因工程在植物學研究中的應用，PAL基因的克隆、表達及功能分析得到了廣泛的研究[5]。到目前為止，已經對棉花（Gossypium spp）[6]、甘蔗（Saccharum officinarum）[7]、山藥（Dioscoreae rhizoma）[8]、芒果（Mangifera indica）[9]等多種植物的PAL基因進行了cDNA克隆與序列分析。植物PAL基因普遍由小的多基因家族組成，在一組染色體中一般含有2～6個PAL，可以分為2～3個不同類群或亞族。多數PAL有均一的亞基，亞基間的結合非常牢固，因此生物體內的PAL是比較穩定的[10]。苯丙烷類化合物的合成以莽草酸為前體，莽草酸途徑途徑產生的L-苯丙氨酸經PAL催化生成反式肉桂酸，隨后進入苯丙烷代謝途徑，經一系列甲基轉移酶和酰基轉移酶的作用形成各種芳香物質[3]，生成的香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產物可進一步轉化成香豆素、綠原酸，再進一步轉化為類黃酮、木質素、生物堿等[11]，因此，PAL對植物內芳香物質形成、色素形成、植物細胞分化，以及木質化過程、植物抗病抗蟲害抗逆境作用等具有重要的意義[12]。

MeJA是一種植物內源激素，最早發現于茉莉屬素馨花中，是茉莉花的主要芳香物質，該激素可參與植物的苯丙烷代謝途徑[13]。馬杰等[14]的研究表明，MeJA處理可以提高鮮切萵苣和甘藍中PAL的活性，從而也增加了次生代謝如酚類物質的增加，由此推測MeJA可能也會提高茉莉花中PAL的活性，從而誘導芳香物質的產生。而MeJA對茉莉花的處理及研究國內外鮮見報道，且目前對茉莉花香氣形成的分子機理研究主要集中在萜類代謝途徑，對苯丙烷代謝途徑的研究相對較少。本研究利用PCR技術克隆了茉莉花香氣形成苯丙烷代謝途徑上PAL基因全長cDNA序列，并對其編碼產物的理化性質和序列特征進行預測；采用100 μmol/L的外源MeJA處理即將開放的茉莉成熟花苞，通過熒光定量PCR技術對JsPAL2在茉莉花不同生長發育、開放時期以及MeJA處理后花朵中的表達量進行分析，對進一步研究茉莉花釋香機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為雙瓣茉莉花，取自福建農林大學教學茶場茉莉資源圃。于18：00時采摘雙瓣茉莉花成熟花苞，稱重并用錫箔紙包裹標記，立即液氮速凍隨后存于–80 ℃冰箱備用。對生長發育形態一致的幼小花蕾進行掛牌（記為1天），每天18：00取生長發育1～5 d的花蕾及花苞（未開放）作為熒光定量的材料，每組取3個生物重復，處理同上。對生長發育形態一致且當晚會開放的成熟花苞進行掛牌，取5個不同開放時期（18：00、20：00、22：00、00：00、2：00）的花朵作為熒光定量材料，每組取3個生物重復，處理同上。對生長發育形態一致且當晚會開放的成熟花苞進行掛牌，于17：00時用100 μmol/L濃度的MeJA噴灑茉莉花，同時用水（H2O）處理作為對照組，分別于0、1、3、5、7、9、11、13 h后摘取茉莉花朵，每組取3個生物重復，花朵處理同上。

1.2 方法

1.2.1 JsPAL2編碼區全長cDNA的獲得 首先提取18：00茉莉成熟花苞的總RNA，采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[百泰克生物技術公司（北京）有限公司]，用RNase-free無菌水溶解RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，RNA濃度及D260/230nm、D260/280nm的測定采用核酸蛋白測定儀。隨后進行cDNA的第一鏈合成，參照TransScript Reverse Transcriptase試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）說明書進行。分析茉莉花轉錄組測序結果，下載已有的苯丙氨酸解氨酶基因的一個EST，利用BLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行分析，其與芝麻（Sesamum indicum）、油橄欖（Olea europae）的相似度均為75%，E value均為0。利用Primer??Pre?mier5軟件根據序列設計引物JsPAL2-F和JsPAL2- R（表1），并利用PCR儀進行cDNA擴增，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶進行膠回收，連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌T1感受態細胞，挑取陽性單克隆，進行菌液PCR驗證，測序工作由上海六合華大生物工程有限公司完成。

1.2.2 茉莉花JsPAL2 cDNA的生物信息學分析 利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）分析茉莉花JsPAL2與其他物種氨基酸同源性，利用DNAMAN進行多重氨基酸序列比對，利用MEGA5.2軟件構建系統進化樹，利用ProtParam、ProtScale軟件進行蛋白質基本理化性質預測，利用PSORT Prediction（http：//psort.hgc. jp/form.html）、TargetP 1.1 Server（http： //www.cbs. dtu.dk/services/TargetP/）進行蛋白質亞細胞定位預測，利用TMHMM Server2.0預測蛋白跨膜結構，利用SignalP 4.1 Server進行信號肽預測，利用NetPho 2.0 Server進行磷酸化位點預測，利用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）進行結構域預測，利用在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預測蛋白質二級和三級結構。

1.2.3 茉莉花的MeJA處理 配制濃度為100 μmol/L的MeJA溶液（用無水乙醇作為助溶劑），選取成熟且即將開放的花苞，于17：00時用配制好的MeJA噴施花苞表面，同時用水（H2O）處理另一組茉莉花作為對照，分別于0、1、3、5、7、9、11、13 h后摘取茉莉花朵，每個時期1 g樣品，重復3次。

1.2.4 JsPAL2實時熒光定量分析 分別提取花蕾生長發育5個時期（1～5d）、5個不同開放時期（18：00、20：00、22：00、00：00、2：00）以及經MeJA處理后的8個時期的茉莉花瓣總RNA，隨后進行逆轉錄合成cDNA作為熒光定量的模板，方法參照GoScriptTM Reverse Transcription System[購于普洛麥格生物技術（北京）有限公司]說明書進行。根據JsPAL2基因全長cDNA序列設計熒光定量PCR引物rtJsPAL2-F， rtJsPAL2-R（表1）。以茉莉花αTublin2基因為內參，設置3個生物學重復，采用GoTaq ?qPCR Master Mix[購于普洛麥格生物技術（北京）有限公司]試劑盒進行JsPAL2熒光定量PCR擴增。

1.3 數據分析

利用Excel 2003通用2–ΔΔCt法對熒光定量數據進行計算，利用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 JsPAL2全長cDNA序列的克隆與序列分析

通過PCR技術克隆得到 JsPAL2全長cDNA的PCR產物（圖1），測序得到該cDNA全長為2 181 bp，編碼693個氨基酸，包含2 079 bp的開放閱讀框（ORF，101～2 180 bp）。該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAG，屬于Lyase class I_like superfamily，并含有PAL活性位點（圖2）。

2.2 JsPAL2的生物信息學分析

JsPAL2氨基酸序列的進化樹（圖3）顯示，植物的PAL基本聚為兩大類，兩大類中又分為多個小聚類，表明其有較高的同源性，其中甜椒（Capsicum annuum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、煙草（Nicotiana attenuata）聚為一類，屬于茄科植物；牽牛花（Ipomoea nil）和紅薯（Ipomoea batatas）聚為一類，兩者都是旋花科植物；粘毛黃岑（Scutellaria viscidula）、羅勒（Ocimum basilicum）和紫蘇（Perilla frutescens）聚為一類，屬唇形科植物。JsPAL2與油橄欖的親緣關系最近。不同科屬植物間也有較高的同源性，如野茶樹[Camellia sinensis（山茶科）]和胡蘿卜[Daucus carota（傘形科）]、蘋果[Malus x domestica（薔薇科）]和葡萄[Vitis vinifera（葡萄科）]。

JsPAL2的蛋白質基本理化性質預測與分析結果顯示，該蛋白編碼693個氨基酸，分子量為75 599.19 u，分子式為C3335H5343N925O1025S25，等電點為5.85，親水性氨基酸占多數，疏水性氨基酸占少部分，正電荷殘基為82個，負電荷殘基為71個，不穩定系數為33.87，屬于穩定蛋白，總平均親水性（GRAVY）為–0.186，脂溶指數為91.93。蛋白跨膜結構預測顯示其為非跨膜蛋白。親疏水性預測結果顯示，親水性域所占比例大于疏水性域，推測該蛋白為親水性蛋白。信號肽預測結果表明，該蛋白分值為0.45，無信號肽，是非分泌性蛋白；結合亞細胞定位預測結果，推測該蛋白最有可能位于細胞質。該蛋白磷酸化位點較多，Ser的磷酸化數量是Thr、Tyr的2倍，位點分布較均勻（圖4）。根據結構域分析，該蛋白屬于芳香族氨基酸裂解酶家族和苯丙氨酸解氨酶家族，包含3個結構域，分別為Fumarase/histidase N末端結構域、L-aspartase結構域和PAL保護結構域；蛋白質結構預測結果（圖5）顯示該蛋白有50.94%氨基酸形成ɑ螺旋結構，11.54%氨基酸形成伸展鏈，29.15%氨基酸形成無規則卷曲，其余8.37%則形成β轉角。

2.3 JsPAL2相對熒光定量PCR表達分析

測定JsPAL2在5個花蕾不同生長發育時期和5個茉莉花不同開放時期的表達量，結果表明（圖6，圖7），在1 d花蕾期時，JsPAL2的表達量最低，隨著花蕾的生長發育，其表達量逐漸上調；在茉莉花不同開放時期中，18：00茉莉花未開放時的JsPAL2表達量最低，隨著時間的推移呈上調的趨勢，在22：00半開放時表達量達到最高，隨后呈下調趨勢。

2.4 處理組及對照組中JsPAL2相對熒光定量PCR表達分析

測定JsPAL2在茉莉花經MeJA處理及H2O處理后8個時期的相對表達量，結果顯示（圖8），在H2O處理后1～5 h時間內（也就是18：00—22：00），JsPAL2的表達量逐漸升高，在5 h時（22：00）達到最高，隨后5～13 h（也就是22：00—06：00）又逐漸下降；在MeJA處理后1～7 h （18：00—24：00）時間內，JsPAL2的表達量亦逐漸增加，在7 h時（24：00）表達量達到最高，隨后下降。對比兩次處理可看出，經MeJA處理過后JsPAL2的表達量明顯增加，最高表達量接近H2O處理的2倍，且最高表達量的時間也由原先的22：00推移到了24：00。

3 討論

植物花香成分主要包括萜烯類、苯丙烷類，脂肪族及其衍生物等1 700多種[15-16]。苯丙烷類化合物合成途徑是花香物質主要合成途徑之一，PAL是苯丙烷代謝途徑中的第一個關鍵限速酶，負責真核生物體內L-苯丙氨酸和反式肉桂酸之間的轉化，因此PAL作為生物催化對之后的苯丙烷化合物形成是非常重要的。本研究獲得的JsPAL2基因的全長共計2 181 bp的cDNA，通過序列分析顯示JsPAL2基因所編碼的氨基酸序列含有PAL保護結構域，在168～184氨基酸位點上含有PAL活性位點。JsPAL2與其他植物具有較高的同源性：油橄欖（Olea europaea）87%、芝麻（Sesamum indicum）80%、野生煙草（Nicotiana attenuata）80%。進化樹分析發現相同科或類群的植物聚為一類，JsPAL2與油橄欖親緣關系最近，同時發現不同植物間也有很高的同源性，由此推測PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一個關鍵限速酶在進化過程中保持了足夠的遺傳穩定性，這與前人的研究結果[17]一致。

孫君[3]克隆了茉莉花中PAL基因的cDNA全長，并通過熒光定量PCR對PAL基因在5個不同開花時期（18：00、20：00、22：00、0：00、2：00）的花瓣中的表達進行了分析，結果顯示PAL基因在未開放的茉莉花中的表達量比開放的低，并在茉莉花半開時（20：00）表達量最高，隨后降低。張芊[18]分別以吐苞2、4 d的花蕾，開放0、12 h以及開敗期的茉莉花為熒光定量材料，檢測PAL基因在此6個時期的表達量，其結果顯示PAL在吐苞2 d、4 d、花開0 h三個時期的表達量依次遞增，在花開12 h時表達量達到最高，開敗期次之，在吐苞2 d時最低。MeJA作為一種生長調節物質，具有增強植物抗性的作用，其機理涉及改變病程相關蛋白，提高苯丙轉氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等防御蛋白的活性，誘導多酚類化合物等次生物質的產生[19-20]，研究[14]表明MeJA處理鮮切萵苣2 h后PAL活性顯著降低，之后緩慢回升，在12 h達到最高值，為對照組的2倍多。同樣，處理鮮切甘藍2 h后PAL活性降低，之后呈單峰變化，在4 h達到最高，是對照組的3倍，說明MeJA通過信號傳遞功能誘導了PAL活性的增加。Kim等[21]和Gumerova等[22]分別證實了MeJA可以提高甜蕎和苦蕎中酚類化合物和蘆丁的含量，雒曉鵬等[23]以苦蕎子葉為材料，經MeJA處理后子葉中總黃酮的含量隨著時間逐漸增加，在6 h達到最大值，隨后稍降低并保持穩定，PAL是苦蕎子葉中黃酮合成關鍵酶基因，在處理6 h后，子葉中PAL的表達量達到最高，是處理前的2.7倍，且總黃酮含量與PAL的表達量呈正相關，由此可見MeJA也刺激了苦蕎子葉中PAL的表達。本研究對JsPAL2在茉莉花生長發育過程和開放過程中的表達動態均進行了分析，另外檢測了經8個不同時間MeJA和H2O處理后JsPAL2表達量的變化，以期研究MeJA對茉莉花中苯丙烷類化合物合成的影響。結果表明，在花蕾生長發育過程中，JsPAL2的表達量隨著生長發育而升高，在5 d表達量達到最高，說明PAL在花蕾生長發育過程中大量積累形成足夠的肉桂酸，為花朵的開放做準備；在開放過程中，茉莉花JsPAL2基因的表達量在18：00未開放時最低，隨著開花程度的增加，JsPAL2的相對表達量也持續升高，在22：00花半開時達到最高，隨后隨著花朵的繼續開放而降低，與孫君[3]和張芊[18]研究結果的表達模式大體一致，在茉莉花生長及開放過程中，JsPAL2的表達量與花香強度呈現一定的關聯，進一步確定該基因可能參與調控茉莉花苯丙烷類化合物的合成。經MeJA和H2O處理后，JsPAL2表達量的變化趨勢與開放過程的變化趨勢一致，即先升高后下降；但不同的是，經MeJA處理后JsPAL2表達量明顯增加，最高表達量對照組的2倍多，且最高表達量的時間由原先的22：00推移至24：00，即在處理后7 h表達量達到最高，與MeJA對鮮切甘藍和苦蕎子葉的影響相似，說明通過外源施加MeJA能夠顯著促進JsPAL2表達量的提高，推遲花朵開放后期JsPAL2表達水平的降低，并有可能提高了JsPAL2的活性，從而誘導并激活了茉莉花中苯丙烷物質的合成通路。本研究為解析JsPAL2參與調控茉莉花中苯丙烷物質的合成，以及進一步研究茉莉花釋香機制提供了理論基礎，但JsPAL2是否調控茉莉花花香物質的合成還需進一步對該基因進行轉基因功能鑒定，另外不同濃度MeJA對茉莉花中JsPAL2的表達量是否有不同影響還有待進一步探究。

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