中國水仙FOMT2基因及啟動子的克隆與分析

張蒙 潘騰飛 余磊 楊華麗 潘東明

摘 要 為探究花色基因FOMT2在中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）類黃酮代謝途徑中的功能作用，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用，本研究以多花水仙“金盞銀臺” （Narcissus tazetta var. chinensis ‘jinzhanyintai）不同時期的花器官為材料，提取總RNA，采用RACE與RT-PCR結合的方法，克隆得到NtFOMT2基因的cDNA全長。結果表明：NtFOMT2基因的cDNA全長為1 404 bp，其中5′ UTR長度為33 bp， 3′ UTR長度為279 bp，開放閱讀框為1 092 bp，共編碼363個氨基酸。定量PCR分析結果表明，NtFOMT2基因表達水平在水仙花器官的不同時期差異很大，其表達模式表現為II>I>III>IV。此外，為分析水仙花色素基因的調節因素，以基因組DNA為模板，采用染色體步移法，成功克隆并分析NtFOMT2基因的5端調控序列。結果表明，NtFOMT2基因啟動子序列除包含起始轉錄位點（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增強子外，還包含多個順式作用元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等多個光響應元件。此外，該啟動子序列還含有MYB參與抗旱誘導的結合位點MBS元件、MYB轉錄因子結合位點等。

關鍵詞 中國水仙；基因；克隆；FOMT；啟動子；類黃酮

中圖分類號 S682.2+1 文獻標識碼 A

Abstract In order to explore the function of FOMT2 gene in the flavonoid metabolic pathway in Narcissus tazetta. Var chinensis， and to clarify the function of the methylation modification of small molecule compounds in the flavonoid metabolism in Narcissus， the research used Narcissus tazetta. Var chinensis ‘Jinzhanyintai as the meterial to extract total RNA， and the full-length cDNA of NtFOMT2 was cloned with the method of RACE and RT. Results showed that the full length cDNA of NtFOMT2 was 1 404 bp， including a 33 bp 5′ UTR， a 279 bp 3′ UTR and a 1 092 bp ORF encoding 363 amino acids. The results of quantitative PCR showed that the expressions of NtFOMT2 in flower had big difference at different periods. The expression pattern was expressed as： II>I>III>IV. Besides， to analyze the regulating factors of pigment genes in N. tazetta， the regulation sequence of the 5 end of NtFOMT2 gene was cloned with the method of chromosome walking. Results showed that the promoter sequence of NtFOMT2 gene also included cis-acting elements such as ACE， ATCT-motif， G-box， Sp1 and many light responsive elements， besides necessary transcription starting site TATA-box and CAAT enhancer. Furthermore， this promoter sequence included a binding site MBS element participating in drought inducement of MYB， and a MBS binding site of MYB transcription factor and so on.

Keywords Narcissus tazetta var. chinensis； gene； cloning； FOMT； promoter； flavonoid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.018

植物的O-甲基化（O-Methyltransferase，OMT）反應是類黃酮化合物分子修飾的一類重要反應，O-甲基化修飾賦予了類黃酮化合物新的生物學活性[1]。Joshi等[2]根據蛋白質的質量和二價離子對酶活的影響，將O-甲基轉移酶（OMTs）分為咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶（CCoAOMT）和咖啡酸O-甲基轉移酶（COMT）2種類型。I類O-甲基轉移酶，即CCoAOMT，其蛋白質量在26～30 ku之間，其酶活性需要依賴二價金屬離子，是合成木質素的關鍵酶；II類O-甲基轉移酶，即COMT，其蛋白質量在40～43 ku之間，其催化活性不依賴于二價金屬離子，可催化咖啡酸等苯丙素類化合物及一些類黃酮和生物堿類物質[2]。其中，FOMT被劃分在II類O-甲基轉移酶中[3]。

植物的O-甲基轉移酶（OMTs）被認為參與了植物次生代謝產物的甲基化，尤其是苯丙烷類和類黃酮化合物[4]。在這些化合物的主干合成后，會發生各種各樣的修飾反應。細胞色素 P450s（P450s）、糖基轉移酶（GTs）和O -甲基轉移酶（OMTs）已被證明參與了修飾反應，從而形成了豐富的類黃酮多樣性[5]。目前，幾個基因編碼黃酮類O-甲基轉移酶已經在分子和生物化學水平上被分離和表征，如長春花[6]、水稻[5]、染色麻花頭[7]、擬南芥[8]、茶樹[3]、銀杏[9]、青稞[10]等植物中均克隆得到了OMT基因。本實驗通過克隆并分析中國水仙NtFOMT2基因及其5端調控序列，根據前人報道的分類，該NtFOMT2基因屬于第二類，常以二聚體形式存在，其催化活性不需要金屬離子存在[11]。近年來，雖然已有許多關于FOMT基因克隆及其表達調控等分子生物學方面的研究，但仍有很多問題需要更深入、更細致的研究。

在前期研究中，柯毅湧[12]認為中國水仙花中未發現花青素存在，可能是因為類黃酮O-甲基轉移酶（Flavonoid -O-Methyltransferase，FOMT）能特異識別蘆丁為底物甲基化形成水仙苷，改變原物質化學活性，使其在結構上更穩定。水仙苷在盛花期前大量積累與花青素爭奪共同的底物二氫槲皮素，從而抑制了花青素的合成[4]。本研究以此為切入點，采用RACE技術，成功分離出中國水仙FOMT2基因的全長cDNA，并對其進行生物信息學分析；采用染色體步移法（Genome Walking Kit），分離NtFOMT2的5端調控序列，對所得序列的順式作用元件進行分析，從而進一步了解水仙FOMT的基因功能，為以后水仙體內類黃酮化合物的甲基化修飾的相關研究提供立論依據，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以多花水仙‘金盞銀臺為材料。選用生長健壯、無病害、無殘缺且大小一致的3年生水仙種球進行土培，下種時間為2016年11月5日。于水仙花芽4個不同生長時期取6個樣品：白色的花芽、綠色的花芽、綠苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠（表1）。將各樣品分別處理好并做好標記，液氮速凍后放于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌（Esherichia coli）DH5α感受態細胞、DNA純化回收試劑盒均為天根公司產品；逆轉錄試劑盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購于全式金公司；啟動子克隆試劑盒Genome Walking Kit購自Takara公司。本文中所用引物均由華大基因合成，其名稱及序列見表2。

1.2 方法

1.2.1 中國水仙FOMT2基因全長cDNA的克隆 參照Biospin?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Biospin Plant Total RNA Extraction Kit）的方法，提取不同時期的花器官混合樣的RNA。以總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書的具體操作合成cDNA。根據已有的多花水仙RNA-seq數據庫篩選得到中國水仙FOMT基因序列，利用Primer Premier 5軟件，設計出5′端RACE和3′端RACE引物（表1），將克隆得到的序列與原序列拼接后的全長設計ORF引物做驗證，引物由華大基因合成。

以多花水仙cDNA為模板進行第1輪PCR擴增，總反應體系為25 μL：其中cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10×Trans Taq-T Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Trans Taq-T DNA Polymerase 0.2 μL，補ddH2O至總體積為25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；35個循環的特異擴增（94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃結束反應。第一輪PCR產物用ddH2O稀釋500倍用做第2輪模板，反應體系與條件和第1輪PCR相同。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，回收目的條帶，連接至pUCm-T載體，轉化DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，將陽性克隆送至上海博尚生物技術有限公司測序。

利用DNAMAN軟件，將克隆得到的5′端序列及3′端序列及轉錄組測得的部分編碼序列進行cDNA全長的拼接，經Blast比對分析，將得到的FOMT基因命名為NtFOMT2。

1.2.2 中國水仙FOMT2基因全長cDNA的生物信息學分析 利用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線比對；利用DNAMAN8軟件對其進行氨基酸序列比對；利用MEGA7軟件構建系統進化樹；利用ExPASy中的Protparam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）對其進行蛋白結構域預測。

1.2.3 NtFOMT2基因在水仙花芽不同發育時期的表達分析 采用Biospin?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取水仙花器官發育不同時期和不同部位的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA。PCR反應體系和程序參照SYBR? Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）在耶拿qTOWER2.2熒光定量儀上進行檢測，引物見表1，每個樣品設3個生物重復和3個技術重復。以actin為內參基因，利用2-△△CT法對水仙FOMT2在水仙花器官不同發育時期和部位的表達進行分析。

1.2.4 NtFOMT2基因5′端調控序列的克隆與分析 采用CTAB法[13]對中國水仙種球中花芽基因組DNA進行提取，參照Takara公司Genome Walking Kit說明書的步驟，根據所獲得的NtFOMT2基因全長序列設計3條巢式引物（表2）。以多花水仙基因組DNA為模板，按照說明書的步驟，以PCR擴增NtFOMT2基因的5′端調控序列，電泳檢測PCR產物并回收目的條帶，按照pEASY-Blunt Cloning Kit說明書取4 μL純化產物與1 μL載體進行連接反應，室溫反應20 min。連接產物轉到T1感受態細胞，轉化完后對陽性克隆進行檢測。用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線對測序結果進行啟動子作用元件分析。

2 結果與分析

2.1 中國水仙FOMT2基因克隆及其生物信息學分析

以多花水仙的花芽cDNA為模板，用FOMT2引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶的清晰度和完整性（圖1），結果獲得的特異條帶與預測的基因片段大小相同，初步確定為目的基因片段。膠回收產物連接、轉化后送測序，將已有的轉錄組數據中NtFOMT2基因中部分序列與獲得的序列進行拼接，得到中國水仙NtFOMT2基因的cDNA全長。在該全長設計ORF引物，以PCR擴增進行驗證。

由圖2可知，NtFOMT2基因的cDNA全長為1 404 bp，其中5′ UTR長度為33 bp，3′ UTR長度為279 bp，ORF為1 092 bp，共編碼363個氨基酸。

2.2 中國水仙NtFOMT2基因的序列分析

將得到的NtFOMT2基因全長在NCBI上進行Blast比對，結果顯示，NtFOMT2基因與中國水仙黃花水仙（Narcissus tazetta var.chinensis ‘huanghuashuixian caffeic acid O-methyltransferase-like protein）咖啡酸O-甲基轉移酶（COMT， KC455936.1）的相似度為97%，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，XM_020829677.1）的同源性為69%，與油棕（Elaeis guineensis，XM_010936612.2）的caffeic acid 3-O-methyltransferase和tricetin 3'，4'，5'-O-trimethyltransferase-like（XM_010936611.2）同源性均為70%。并且與海棗（Phoenix uctylifera，XM_008790507.2）、煙草、大豆、蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，XM_020723616.1）等植物的COMT基因進行了比對。基本理化性質預測分析結果表明，NtFOMT2基因編碼363個氨基酸，蛋白分子量為40.00 ku，原子組成為C1790H2810N464O527S23，理論等電點為5.19，負電荷的氨基酸殘基數為49，正電荷的氨基酸殘基數為36，不穩定系數為28.56。上述結果均表明克隆得到的序列為中國水仙FOMT2基因。

選取18種植物的OMT氨基酸序列與NtFOMT2氨基酸序列構建NJ系統進化樹。結果顯示，OMT系統發育樹分為兩大類，其中中國水仙“金盞銀臺”與“黃花水仙”、“黃花水仙2號”的OMT歸為第二類，與第一類中的胡桃、垂枝樺、茶樹、海棗、大葉楊、胡蘿卜、油棕等植物的OMTs在進化上有明顯區分，這表明不同科屬植物之間的OMT氨基酸序列呈現明顯差異，以100%的bootstrap支持度形成一個分支，在此分支下，不同科屬植物種類形成一個分類群（圖3）。

2.3 中國水仙FOMT2基因的定量表達分析

由圖4可知，NtFOMT2基因在佛焰總苞形成初期、佛焰總苞形成中期、綠苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠中均有表達，但不同發育時期表達水平存在較大差異。其中佛焰總苞形成中期表達量最高，佛焰總苞形成初期表達量居中，綠苞期和盛花期均下降。

2.4 中國水仙FOMT2基因的5端序列及其分析

將得到的5端調控序列提交到在線軟件PlantCare上進行分析，結果表明，中國水仙FOMT2基因啟動子序列除包含必需的起始轉錄位點（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增強子外，還有ATCT-motif、ACE、G-box、Sp1等多個光響應元件（圖5）。此外，該啟動子序列還含有真菌誘導子響應元件Box-W1、表達分生組織相關元件CAT-box、參與茉莉酸甲酯響應的順式調控元件CGTCA-motif、TGACG-motif及MYB參與抗旱誘導的結合位點MBS元件，并且還發現一個MYB轉錄因子結合位點MBS。同時對NtFOMT2基因啟動子順式調控元件的功能進行推測，結果見表3。

3 討論

植物OMT家族因底物多樣性形成龐大的甲基轉移酶家族，類黃酮OMTs通過爭奪黃酮羥基中的質子轉移甲基而改變底物結構，并改變底物的理化性質和功能[10]。目前關于植物OMTs cDNA的克隆及其結構、功能的研究較多，但極少有從啟動子及其所受轉錄調控機制著手研究的。本研究成功克隆了中國水仙“金盞銀臺”FOMT2基因的全長，通過Blast比對并用MEGA軟件建樹分析可知，“金盞銀臺”FOMT2基因與“黃花水仙”有很高的同源性。但在感官上可知，“金盞銀臺”為白色花瓣，黃色副冠；“黃花水仙”的花瓣、副冠均為黃色系，但副冠的黃色較深。因此說明花色的形成是一個復雜的過程，并且合成物質受多種酶的共同協調作用。從水仙花色類黃酮生物合成途徑可知，甲基化反應是類黃酮化合物分子修飾的一類重要反應，O-甲基化修飾賦予了類黃酮化合物新的生物學活性。因此，研究FOMT基因在水仙中不同時期不同器官的表達量，將有助于揭示水仙花色形成相關基因表達之間的動態關系，進而為水仙花色研究提供新思路。

從表達特性看，NtFOMT2基因在佛焰總苞形成期表達量迅速增加，在綠苞期和盛花期的花瓣和副冠中表達量均降低，說明該基因的表達為下調模式，這種表達模式與其同源基因銀杏FOMT和葡萄AOMT的表達模式相似。已有研究結果發現銀杏葉片中該基因表達模式為春季幼葉>秋季老葉>夏季成熟葉，其表達也為下調模式[9]。葡萄AOMT屬可誘導表達基因，其表達產物AOMT可能參與了花青素甲基化反應。以此類推，NtFOMT2基因表達產物NtFOMT2可能參與了類黃酮甲基化反應。

本研究得到的NtFOMT2基因啟動子序列中存在1個MYB參與抗旱誘導的結合位點MBS元件，該元件可能受MYB調控參與了干旱脅迫信號的響應及轉錄調控機制；并發現1個MYB轉錄因子結合位點MBS，進一步說明NtFOMT2基因的表達可能受MYB轉錄因子的調控。此外，該啟動子序列還含有多個光響應元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等，通過這些元件可推測NtFOMT2基因可能參與光合反應或受光信號因子調控。類黃酮物質的生物合成過程相當復雜，其生物代謝途徑受到大量關鍵酶基因的直接影響，而這些酶基因的表達又受到相應轉錄因子的調控[14]。基因啟動子區轉錄調控元件的識別是研究基因轉錄調控機制進而構建基因表達調控的關鍵，生物信息學方法是解決該類問題的重要手段[15]。目前，人們已在植物中找到了很多調控黃酮類此生代謝的轉錄因子基因。已從擬南芥[16]、矮牽牛[17-18]、長春花[19]等許多植物中分離和鑒定了控制次生代謝的多種轉錄因子。Debora等[20]發現在葡萄的生長發育過程中，花青素甲基化受干旱脅迫誘導，影響了花青素的積累，并通過實驗得出OMT在干旱脅迫下可能增強葡萄中花青素的甲基化活性的結論。Gao等[21]研究發現MYB轉錄因子可能通過抑制花青素的合成，參與了植物花色的積累過程。楊文杰等[22]從大豆中克隆出2個MYB基因；通過酵母系統檢測結果表明，GmMYBZ2基因可能也參與植物類黃酮合成的調控[23]。綜上所述，本研究分離出中國水仙NtFOMT2基因的cDNA全長及5端調控序列，并且分析了其包含的相關順式作用元件在脅迫響應和不同信號分子誘導中的調控功能，為今后分離出與之相關調控序列特異結合的轉錄因子提供了依據，以期明確小分子化合物甲基化修飾在水仙類黃酮代謝中的作用，同時也為闡明調控該基因表達的信號轉導途徑提供重要資料。

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