瓜實蠅性別決定基因tra—2的克隆及表達分析

曾秀丹 龔治 彭正強 金啟安 溫海波 馬光昌

摘 要 本研究對瓜實蠅Bactrocera cucurbitae Coquillett的性別決定基因tra-2的cDNA序列進行了克隆和分析。根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)庫及序列同源性分析，分別克隆并獲得瓜實蠅雌雄成蟲tra-2的基因片段，利用生物信息軟件對所得序列進行分析；采用qPCR技術，研究該基因在瓜實蠅不同發(fā)育階段的表達情況。研究結果表明，瓜實蠅tra-2基因的cDNA序列共1 450 bp，無性別特異性，含753 bp的開放閱讀框，共編碼250個氨基酸。該基因在瓜實蠅不同發(fā)育階段均有不同的表達量，瓜實蠅tra-2基因具有母體遺傳表達特性，在胚胎期的表達量較高，雌成蟲表達量顯著高于雄成蟲。

關鍵詞 瓜實蠅；性別決定；tra-2；qPCR

中圖分類號 S433 文獻標識碼 A

Abstract In this paper， the sex determination gene tra-2 cDNA sequence of B. cucurbitae Coquillett was cloned and analyzed. According to the transcriptome database and sequence homology analysis， the male and female tra-2 gene fragments of the B. cucurbitae were cloned and analyzed by bioinformatics software. The qPCR technique was used to study the effects of different development stage of the expression of the situation. The results showed that the cDNA sequence of tra-2 gene of B. cucurbitae was 1 450 bp in length， without sex-specific transtript. The open reading frame of tra-2 was 753 bp in length， which encoding a polypeptide of 250 amino acids. tra-2 gene of B. cucurbitae had different expression levels in different developmental stages. It had maternal genetic effects with high expression in the embryonic period， and female adult expressed significantly more than male adult.

Key words melon fly； sex determination； tra-2； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.020

瓜實蠅Bactrocera cucurbitae Coquillett，屬雙翅目Diptera，實蠅科Tephritidae，為中國進境植物檢疫性有害生物[1]，屬于鉆蛀性害蟲，危害葫蘆科、茄科以及番木瓜、番石榴等120多種蔬菜和水果[2-7]，已在我國廣東、廣西、海南等地造成嚴重危害[5， 7-11]。瓜實蠅繁殖能力強，一年發(fā)生多代，世代重疊，以蛹或成蟲越冬[12]，嚴重危害到各類果蔬的種植與生產(chǎn)[13-15]。

昆蟲種類繁多，其性別決定機制復雜多樣，了解昆蟲的性別決定機制，有助于理解昆蟲性別分化調控的過程，為人類有效控制害蟲、高效利用益蟲提供新的方向。昆蟲的性別決定機制分為環(huán)境性別決定和遺傳性別決定，目前環(huán)境性別決定的分子研究還較少，而對遺傳性別決定的研究很多。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中，性別決定是一個遺傳級聯(lián)式過程，主要涉及性染色體初始信號原件、sxl、tra、tra-2、dsx等基因[16-17]。明確昆蟲的性別調控機制，結合RNAi技術，可人為調控昆蟲的性別發(fā)育方向，用于昆蟲不育技術的研究[18]。

本研究利用基因克隆技術，得到瓜實蠅性別決定基因tra-2的全長序列，并對氨基酸序列進行分析，利用熒光定量qPCR技術對該基因在瓜實蠅不同發(fā)育階段的表達量進行了分析，為該基因日后的功能研究及釋放攜帶顯性致死基因的技術研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：瓜實蠅為中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所入侵害蟲課題組提供。成蟲與幼蟲均以人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為（27±0.5）℃，RH （50±5）%，光周期為14L ： 10D。

試劑：TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、TransScript?Tip Green qPCR SuperMix等均購于北京全式金生物有限公司，Gel Exteaction Kit、Gel Mini Kit購于美國Omega Bio-Tek，無水乙醇購于西隴科學，三氯甲烷購于廣州化學試劑廠，甘油購于Solarbio。

儀器：Centrifuge 5810R臺式冷凍高速離心機、Thermo Scientific PCR儀、Thermo Scientific（Nanodrop 2000c）超微量紫外分光光度計、Applied Biosystems QuantStudio 6熒光定量PCR儀。

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