溫郁金白絹病菌的生物學特性及藥劑毒力測定

馬瑞 徐剛 鄭樊 鄭妃慶 謝昌平

摘 要 為明確溫郁金白絹病菌（Sclerotium rolfsii）的生物學特性及對殺菌劑的敏感性，本實驗研究了不同培養條件對病原菌菌絲生長和菌核形成的影響，并測定了10種殺菌劑對病原菌的抑制作用。結果表明，該菌菌絲生長和菌核形成的最適溫度范圍為30～32 ℃，適宜pH范圍為5～7，適宜培養基為燕麥和玉米培養基；持續黑暗有利于菌絲生長，光暗交替有利于菌核形成；不同碳源和氮源對菌絲生長和菌核形成的影響差異顯著，其中蔗糖和硝酸鈉分別為最適碳源和氮源；菌絲和菌核致死溫度分別為50 ℃和55 ℃。烯唑醇對該菌的抑制作用最強，EC50為0.141 2 mg/L；其次是吡唑醚菌酯、苯醚甲環唑和氟硅唑；而代森鋅和百菌清的抑制作用最差，不適合用于防治溫郁金白絹病。

關鍵詞 溫郁金；白絹病；齊整小核菌；生物學特性；毒力

中圖分類號 S435.4 文獻標識碼 A

Abstract To clarify the biological characteristics and sensitivity to different fungicides， the effects of different culture condition on the hyphal growth and sclerotia formation of Sclerotium rolfsii were determined， and the inhibitory activities of ten fungicides on S. rolfsii were also studied. The results showed that the opitimum temperature was 30～32 ℃， the suitable pH was 5～7， oat and corn medium were the appropriate medium for hyphal growth and sclerotia formation. Continuous darkness condition was beneficial to hyphal growth， while the alternation of light and darkness was conducive to sclerotia formation. Effects for carbon and nitrogen sources on hyphal growth and sclerotia formation were significantly different， the optimal carbon and nitrogen source were sucrose and sodium nitrate， respectively. The lethal temperature of hyphal and sclerotia were 50 ℃ and 55 ℃， correspondingly. The toxicity test showed that diniconazole had the best inhibitory activity with EC50 of 0.141 2 mg/L among all fungicides， followed by pyrazole-kresoxim-methyl， difenoconazole and flusilazole. The inhibitory activities of zineb and chlorothalonil were lower and not suitable for controlling Curcuma wenyujin southern blight.

Keywords Curcuma wenyujin； southern blight； Sclerotium rolfsii； biological characteristics； toxicity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.022

溫郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）是我國應用最廣的姜科藥用植物之一，也是著名的“浙八味”之一，在我國已有1 000多年的種植歷史，原產于浙江瑞安[1-3]，近年來在江西、福建、海南、貴州等地區均有栽培，全國種植面積超過1 333 hm2[4]，其藥用價值巨大，根莖中所含揮發油和姜黃素類化合物可以有效預防和治療癌癥，除此之外，溫郁金源藥材在保肝、抗氧化、抗炎癥等方面也有著良好的療效[5-7]。

海南省于1997年開始引進種植溫郁金，先后在海口市、澄邁縣和臨高縣建立了溫郁金種植基地，但由于溫郁金栽培年限較短和對環境的適應能力不強，病害問題已成為制約海南省溫郁金產業發展的一個重要因素。2016年11月筆者在田間調查中發現，一種溫郁金新病害白絹病尤為嚴重，該病害主要為害近地面的莖基部和葉鞘，發病植株莖基部皮層腐爛，表面覆蓋白色絹絲狀菌絲層及白色至茶褐色菌核，葉片變黃凋萎，嚴重時全株萎蔫枯死。該病害發病速度快，蔓延迅速，重病區發病率高達90%以上，嚴重影響了溫郁金的產量和藥理品質，造成了巨大的經濟損失。采集具有典型發病癥狀的溫郁金莖部，經過病原菌的分離、純化和致病性測定，得到溫郁金白絹病菌株JN0610，觀察菌落的培養特性、菌絲和菌核的形態特征，結合ITS基因測定結果將病原菌鑒定為齊整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.）[8]。

齊整小核菌屬于土傳性真菌，寄主范圍很廣，可侵染農作物、園藝作物、雜草和森林樹木等[9]，目前在煙草、花生、芝麻和藥用植物上相關報道較多[10-19]。為進一步了解溫郁金白絹病的發生發展規律，擴大防治藥劑的選擇范圍，本文對病原菌的生物學特性及多種高效殺菌劑的毒力進行了測定，以期通過調控環境條件降低病害的發生途徑，同時為病害綜合防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：2016年11月分離自海南省海口市瓊山區紅旗鎮的溫郁金種植基地中感病溫郁金莖基部，由本實驗室4 ℃低溫保存備用。

1.2 方法

1.2.1 生物學特性測定

（1）溫度對病原菌生長及菌核形成的影響 在PDA平板上接種5 mm直徑的病原菌，30 ℃培養2 d后，用內徑5 mm的打孔器從菌落邊緣切取菌餅，接于PDA培養基平板中央，將PDA平板分別放置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃溫度梯度下的培養箱中黑暗培養，每處理設3次重復。2 d后用十字交叉法測量菌落直徑，并計算3次重復的平均值，平均值減去5 mm作為病原菌實際生長的菌落直徑。15 d后記錄產生的菌核數量。

（2）pH對病原菌生長及菌核形成的影響 將滅菌后的PDA培養基用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將pH分別調節到3、4、5、6、7、8、9和10，將直徑5 mm的菌餅接種到上述不同pH的PDA平板上，置于30 ℃培養箱中黑暗培養，每處理設3次重復。供試菌株與測試方法同第1.2.1（1）節。

（3）培養基對病原菌生長及菌核形成的影響 供試8種培養基分別為PDA、PCA（馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）、PSA（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）、Czapek培養基（MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、KCl 0.5 g、NaNO3 2 g、蔗糖30 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）、Richards培養基（KNO3 10 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、蔗糖50 g、FeCl2 0.02 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）、燕麥培養基（燕麥片30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）、玉米粉培養基（玉米粉300 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）和麥麩培養基（麥麩300 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）。供試菌株與測試方法同第1.2.1（1）節。

（4）碳氮源對病原菌生長及菌核形成的影響 基礎培養基選用Czapek培養基，測試不同碳源時，分別用等碳當量的果糖、肌醇、麥芽糖、木糖、葡萄糖、乳糖和山梨醇代替其中的蔗糖，以不加碳源作對照；測試不同氮源時，分別用等氮當量的NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和Ca（NO3）2代替其中的NaNO3，以不加氮源作對照。供試菌株與測試方法同第1.2.1（1）節。

（5）光照對病原菌生長及菌核形成的影響 在30 ℃下分別設置連續光照、連續黑暗和12 h光暗交替3個處理，供試菌株與測試方法同第1.2.1（1）節。

（6）菌絲和菌核致死溫度的測定 將直徑為5 mm的菌餅和20粒菌核置于裝有少量無菌水的離心管中，在45～55 ℃（梯度為5 ℃）恒溫水浴鍋中加熱10 min，之后用流水使其迅速冷卻，在超凈工作臺上將菌餅和菌核分別轉接至PDA平板上，于30 ℃培養箱中恒溫培養2 d，每處理重復3次，根據菌絲生長和菌核萌發情況確定菌絲和菌核的致死溫度。

1.2.2 室內藥劑毒力測定

（1）供試藥劑 供試藥劑名稱及濃度如表1所示。

（2）藥效測定 藥劑對菌絲生長影響采用生長速率法測定。將供試藥劑用滅菌水按比例進行混合溶解后，加入放置到室溫的PDA培養基中進行倒板。每種藥劑設5個濃度梯度，以不添加藥液的PDA平板為空白對照。在平板中央接種直徑5 mm的菌餅，每處理重復3次，置于30 ℃培養箱中黑暗培養，3 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對菌絲體生長的相對抑制率，以藥劑濃度的對數值為自變量x，以菌絲體抑制百分率的幾率值為因變量y，計算出毒力回歸方程和相關系數R，根據回歸方程計算出EC50。

1.3 數據分析

實驗數據采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016軟件進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 生物學特性測定

2.1.1 溫度對病原菌生長及菌核形成的影響 病原菌在15～35 ℃的條件下均能生長，在28～35 ℃能產生成熟菌核，其中30～32 ℃菌落直徑最大，培養2 d后達到8.95～9.00 cm；產生菌核數量也最多，培養15 d后產生78～87個，無顯著差異，因此可視為最適生長溫度；超過35 ℃時菌絲生長量急劇下降，40 ℃以上不能生長，低于25 ℃或高于40 ℃不能產生菌核（圖1）。

2.1.2 pH對病原菌生長及菌核形成的影響 病原菌在pH為3～9范圍內均能生長，在pH為3～7范圍內菌落擴展較快，pH為5～6時菌絲生長最快，無顯著差異，2 d后菌落直徑達到7.77～7.93 cm，說明與堿性相比，弱酸性更有利于溫郁金白絹病菌的生長。病原菌在pH為4～9范圍內可以產生成熟菌核，pH為7時產生的菌核數量最多，顯著高于其他pH的菌核數量（圖2）。

2.1.3 培養基對病原菌生長及菌核形成的影響 不同培養基對菌絲生長具有顯著的影響。在PDA

和燕麥培養基上菌絲生長速度較快，培養2 d菌落直徑均大于7.50 cm；其次是PCA、PSA和玉米培養基，培養2 d菌落直徑均為7.28 cm，無顯著差異；在麥麩、Czapek和Richards培養基上菌絲生長速度最慢。從菌核數量來看，不同培養基間也存在顯著差異。其中玉米和燕麥培養基產生菌核較多，15 d分別產生177個和114個；其次是麥麩和PSA培養基，Czapek、PDA和PCA培養基產生菌核數量少，Richards培養基則不能產生菌核（圖3）。

2.1.4 碳氮源對病原菌生長及菌核形成的影響 不同碳源對菌絲生長和菌核形成有顯著的影響。在供試碳源分別作為唯一碳源并配以NaNO3為氮源的營養條件中，蔗糖中的菌絲生長最佳，培養2 d菌絲直徑達到6.05 cm；其次是不加碳源的對照、山梨醇、麥芽糖和葡萄糖，在肌醇、果糖、木糖和乳糖中菌絲生長較慢。對于菌核數量而言，培養15 d蔗糖中產生的菌核最多，為25個；其次是山梨醇和不加碳源的對照培養基；其他碳源培養基中均不產生菌核（圖4）。

不同氮源對菌絲生長和菌核形成的影響也具有顯著差異。在供試氮源分別作為唯一氮源并配以蔗糖為碳源的營養條件中，菌絲生長對氮源的利用以NaNO3最佳，培養2 d菌絲直徑達到6.92 cm，其次是 （NH4）2SO4、Ca（NO3）2、NH4Cl，不加氮源的對照和NH4NO3最次。培養15 d，NaNO3中產生菌核數量最多，為25個，其次是NH4NO3、Ca（NO3）2和（NH4）2SO4，NH4Cl中產生菌核較少，不加氮源的對照則不產生菌核（圖5）。

2.1.5 光照對病原菌生長及菌核形成的影響 不同光照條件對菌絲生長和菌核形成具有顯著影響。培養2 d后，菌絲在連續黑暗條件下生長最快，直徑為8.70 cm；其次是光暗交替條件，直徑為8.32 mm；在連續光照條件下生長最慢，直徑為7.93 cm。培養15 d后，在光暗交替條件下產生的菌核最多，為316個；其次為連續光照條件，產生223個；在連續黑暗條件中產生菌核最少，為17個（圖6）。

2.1.6 菌絲及菌核致死溫度的測定 如表2所示，供試菌株在50 ℃水浴鍋中處理10 min后，菌絲不能正常生長，菌核可以正常萌發；在55 ℃水浴鍋中處理10 min后，菌絲和菌核均無法正常生長和萌發。因此，菌絲和菌核的致死溫度分別為50、55 ℃。

2.2 室內藥劑毒力測定

供試10種藥劑對溫郁金白絹病病原菌菌絲生長的抑制作用差異較大，共有4種藥劑的EC50小于1 mg/L，分別為烯唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環唑和氟硅唑。其中烯唑醇的抑制作用最強，EC50為0.141 2 mg/L；五氯硝基苯、代森錳鋅、惡霉靈和中生菌素的抑制作用相對較弱，EC50小于100 mg/L；而代森鋅和百菌清的抑制作用最差，EC50均大于100 mg/L，因此不適合用于防治溫郁金白絹病（表3）。

3 討論

白絹病病原菌齊整小核菌S. rolfsii的寄主范圍很廣，已知危害100多科中的200多種植物[20]。本研究測定了溫郁金白絹病菌的生物學特性，結果表明菌絲生長和菌核形成的最適溫度為30～32 ℃，與王雅等[13]、唐偉等[21]的研究結果一致。海南屬熱帶季風氣候，高溫高濕為該病的發生流行提供了有利條件。菌絲和菌核的致死溫度分別為50 ℃和55 ℃，這可能是由菌核特殊的致密結構造成的，與李小霞等[17]研究草烏白絹病菌的致死溫度結果一致。溫郁金白絹病菌對酸堿度的適應范圍較廣，在pH 3～9時均能生長；pH 5～6時菌絲生長最好，pH 7時產生菌核最多。這與劉佳等[16]、傅俊范等[12]、戰徊旭等[11]的研究結論相似，均表明弱酸性至中性環境更有利于該菌的生長。黑暗條件更有利于菌絲的生長，但不利于菌核的產生，說明菌絲生長和菌核形成對光照的要求不同。

碳源和氮源對微生物的生長發育起著重要的作用，本研究結果顯示，溫郁金白絹病菌能廣泛利用碳氮源，但對不同碳氮源的利用有較大差異。在8種供試碳源中，最大菌落與最小菌落平均直徑的差異高達5.27 cm；5種供試氮源中，最大菌落與最小菌落平均直徑相差1.27 cm，說明不同碳源對該菌生長的影響明顯大于氮源。在8種供試碳源中，只有蔗糖和山梨醇培養基中能產生菌核，其余碳源均不能產生菌核，而在5種供試氮源中都能產生菌核，且不加氮源的對照培養基不能產生菌核，說明菌核的形成對氮源的需求明顯大于碳源。

有關白絹病菌毒力測定的研究很多，謝瑾卉等[22]在研究9種殺菌劑對花生白絹病菌的室內毒力測定時，認為三唑類脫甲基抑制劑己唑醇抗菌活性極高，具有廣譜性的保護和治療作用；李麗等[23]在研究鳶尾白絹病綜合防治時，認為丙環唑、烯唑醇有較好的抑制作用。本研究在室內條件下測定了10種殺菌劑對溫郁金白絹病菌的毒力，結果表明三唑類殺菌劑烯唑醇、苯醚甲環唑和氟硅唑對病菌的抑制效果較好，EC50分別為0.141 2、0.278 5、0.542 2 mg/L，與前人的研究結果相似；除此之外，吡唑醚菌酯和五氯硝基苯在較低濃度對病菌也有著較好的抑制作用，因而在實際防治過程中可以輪換使用，避免單一藥劑長時間使用產生的抗藥性問題。此次藥劑研究結果拓寬了溫郁金白絹病田間防治過程中藥劑種類的選擇范圍，但要確定上述藥劑是否為防治該病的首選藥劑，還需要進一步進行田間防治效果試驗，并對施藥期及方式等進行研究。

溫郁金白絹病的發生流行與栽培管理、氣候條件等關系密切，要防治該病害，不能片面使用化學防治方法，需要根據病菌的生物學特性綜合考慮各種因素才能達到較好的防治效果。因此，每年應在溫濕度較大的季節對溫郁金各種植區提前做好白絹病發生動態的監測預報工作，盡量在白絹病潛育期或是發生前期進行藥劑防治，以防大面積發生，造成不必要的損失。

參考文獻

[1] 方露敏， 黃 真. 溫郁金的研究進展[J]. 中華中醫藥學刊， 2008， 26（9）： 1 998-2 000.

[2] 吳志剛， 陶正明， 冷春鴻， 等. 溫郁金本草考證[J]. 中藥材， 2009， 32（3）： 455-456.

[3] 蔡永敏， 郭文靜， 郝鵬飛. 姜黃源植物的考證[J]. 中草藥， 2016， 47（1）： 183-186.

[4] 潘翔翔， 鄭福勃. 2016年溫郁金價格飆升原因分析及2017年市場預測與建議[J]. 浙江農業科學， 2017， 58（5）： 842-844.

[5] 王 琰， 王慕鄒. 姜黃屬常用中藥的研究進展[J]. 中國藥學雜志， 2001， 36（2）： 80-84.

[6] 肖小河， 蘇中武， 喬傳卓， 等. 姜黃屬藥用植物研究進展[J]. 中草藥， 1997， 28（2）： 114-119.

[7] 尹國平， 張清哲， 安月偉， 等. 溫郁金化學成分及藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2012， 37（22）： 3 354-3 360.

[8] Ma R， Li G M， Xie C P， et al. First report of southern blight on Curcuma wenyujin caused by Sclerotium rolfsii in China[J]. Plant Disease， 2017， 101（4）： 633.

[9] Flore-Moctezuma H E， Montes-Belmont R， Jimenez-Perez A， et al. Pathogenic diversity of Sclerotium rolfsii isolates from Mexico， and potential control of southern blight through solarization and organic amendments[J]. Crop Protection， 2006， 25（3）： 195-201.

[10] 王 靜， 趙 杰， 錢玉梅， 等. 山東煙草白絹病病原鑒定及室內防治藥劑篩選[J]. 中國煙草科學， 2013， 34（4）： 55-59.

[11] 戰徊旭， 王 靜， 王鳳龍， 等. 四川省煙草白絹病病原菌的分離鑒定及其生物學特性[J]. 煙草科技， 2014， 318（1）： 85-88.

[12] 傅俊范， 劉 波， 周如軍， 等. 遼寧花生白絹病病原鑒定及其生物學研究[J]. 中國油料作物學報， 2014， 36（5）： 635-640.

[13] 王 雅， 黃思良， 何朋朋， 等. 芝麻白絹病病原菌的分離鑒定及其生物學特性[J]. 中國油料作物學報， 2013， 35（1）： 84-91.

[14] Gao X Y， Yin J L. Overview of southern blight in Chinese medicinal plants[J]. Plant Diseases and Pests， 2010， 1（1）： 28-34.

[15] 茹水江， 王漢榮， 王連平， 等. 白術白絹病病原生物學特性及其防治藥劑篩選[J]. 浙江農業學報， 2007， 19（6）： 439-443.

[16] 劉 佳， 羅漢鋼， 鄭 莉， 等. 蒼術白絹病病原菌生物學特性初步研究[J]. 湖北農業科學， 2007， 46（2）： 241-243.

[17] 李小霞， 肖仲久， 李 黛， 等. 草烏白絹病生物學特性研究[J]. 廣東農業科學， 2010， 37（8）： 128-130.

[18] 陳 婧， 桑維鈞. 道真玄參白絹病病原鑒定及殺菌劑毒力測定[J]. 湖北農業科學， 2015， 54（20）： 5 020-5 024.

[19] 李海明， 林江波， 王偉英， 等. 鐵皮石斛白絹病菌的分離鑒定與抑菌藥劑篩選[J]. 福建農業學報， 2015， 30（9）： 901-904.

[20] 金 蘋， 高曉余. 白絹病的研究[J]. 農業災害研究， 2011， 1（1）：14-22.

[21] 唐偉， 朱云枝， 強勝. 加拿大一枝黃花白絹病（Sclerotium rolfsii）菌株SC64的生物學特性研究[J]. 南京農業大學學報， 2011， 34（2）： 67-72.

[22] 謝瑾卉， 朱茂山. 9種殺菌劑對花生白絹病菌的室內毒力測定[J]. 遼寧農業科學， 2015（3）： 70-72.

[23] 李 麗， 屠 莉， 肖 迪， 等. 鳶尾白絹病發生動態與綜合防治研究[J]. 中國植保導刊， 2016， 36（8）： 26-32.