基于近紅外光譜技術的白茶總黃酮含量快速測定

沈詩鈺 孫威江 唐琴

摘? 要? 本文依靠近紅外光譜技術對白茶進行總黃酮含量的快速判別。對91份來自不同廠家、不同年份和不同等級的白茶進行總黃酮含量的測定，并采集白茶近紅外光譜圖，運用TQ analyst 8.0軟件進行分析，比較了不同光譜預處理方法，最終采用偏最小二乘法建立白茶總黃酮含量的定量模型。研究結果表明，所建立的總黃酮定量模型的相關系數為0.999 77，校正均方根差為0.043 5，驗證均方根差為0.180，驗證集平均相對誤差為2.89%。該模型預測結果較好，能夠準確、快速、無損地對白茶總黃酮含量進行定量分析。

關鍵詞? 白茶;總黃酮含量;快速測定;近紅外光譜技術中圖分類號? TS272.7???? 文獻標識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.025

白茶為中國名茶，因其不炒不揉的獨特工藝保留了茶葉原始的清香和甘爽的滋味，備受人們的喜愛^[1]。黃酮類物質是多酚類中的重要組分，對茶葉感官品質、生理功能等起重要作用。在六大茶類中白茶的黃酮類物質含量最高，茶葉中的黃酮類物質不僅影響茶葉的滋味和色澤，也因其卓越的保健功效越來越受大眾的關注^[2]。大量研究表明黃酮類化合物在抗衰老、加強免疫力、預防癌癥、降低高血壓和糖尿病的發生率、抵抗病毒、抑制細菌的繁殖、抗疲勞、預防鈣流失等方面有一定作用^[3-9]。黃酮類化合物是白茶重要的品質成分，也是重要的保健成分，進一步加強對黃酮類化合物的研究對白茶品質研究和品牌推廣有著重要意義。依靠近紅外光譜技術能夠快速準確地判別白茶中的總黃酮含量，極大地提高了檢測效率，提高了生產效益，在生產實踐中具有廣闊的開發前景。

近紅外光譜的范圍在可見光與中紅外光譜之間，近紅外區域的主要信息來源于-CH、-NH、-OH等含氫基團的倍頻和合頻吸收，這些基團的基頻吸收出現在中紅外區，因此，絕大多數物質在近紅外區域都有相應的吸收帶，都能通過近紅外光譜技術做定量分析。近紅外光譜作為一種新型檢測手段，在茶葉質量檢測中發揮了越來越重要的作用。如王曼等^[10]應用近紅外光譜技術對黃山毛峰茶的鮮葉品質和等級做出快速判別，周小芬等^[11]利用近紅外光譜技術對大佛龍井茶的感官指標和品質指標進行快速預測，建立了科學準確的茶葉品質評價方法。此外，近紅外光譜技術還在年份判別^[12-14]、真偽檢測^[15-17]、品種檢測^[18-19]發揮著重要作用。

傳統的茶葉物質中總黃酮的定量測定主要為三氯化鋁比色法，但由于該方法前處理投入時間長，人員需求多，對實驗結果的準確性和穩定性都有較大影響，不適合大量數據分析。近紅外光譜技術能對樣品進行快速無損的在線檢測，耗時少，操作簡便^[20]。目前，利用近紅外光譜技術對茶葉中品質成分的測定分析主要為茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶紅素、茶黃素等，對白茶總黃酮含量測定鮮有研究。本研究將測定的總黃酮含量的真實值與其近紅外光譜圖相關聯，通過化學計量法建立定量模型，以達到快速測定的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 材料：白茶茶樣均采購于福鼎市內各大茶企，為2001—2017年生產的不同等級（白毫銀針、白牡丹、壽眉）、不同廠家的茶樣，共91個樣品。為保證樣品的差異性，取樣時，每個批次作為1個樣本。樣品清單如表1所示。

試劑：氯化鋁（批號：20100114），國藥集團化學試劑有限公司;槲皮素對照品（批號：DST160928-028，純度≥98%），成都德思特生物技術有限公司。

1.1.2 ?儀器與設備? Antaris II 傅里葉近紅外光譜儀（Thermo fisher scientific，美國），紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），BSA124S電子天平（Sartorius，德國），高速粉碎機（上海鼎廣機械設備郵箱公司），電熱烘干箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 近紅外光譜的采集? 取上述91份白茶茶樣，粉碎后過80目篩，裝袋密封。

測定方法：應用積分球固體采樣模塊，每個白茶樣品粉末裝樣約13 g，搖晃樣品杯，使得樣品勻整緊密地放入樣品杯中，并將樣品杯底部擦拭干凈，不得沾染茶粉，待測。分辨率8 cm^–1，掃描次數64次，掃描范圍10 000～4 000 cm^–1，扣除背景，Gain選擇2×，以空氣作為參比，使用空調控制室溫，恒定在25 ℃，采集白茶茶樣近紅外光譜圖，每個樣品重復3次，取平均值。

1.2.2? 白茶總黃酮含量的測定? 白茶總黃酮含量的測定采用三氯化鋁比色法，參照袁華芳^[21]的研究方法。黃酮類化合物與三氯化鋁反應生成黃酮的鋁絡合物，并且茶葉中的黃酮類物質多以糖苷為主，因此可用槲皮素為基準物質做定量標準曲線，達到定量檢測的目的。

以槲皮素為對照品，如圖1可知，槲皮素在420 nm處有最大吸收峰，因此以420 nm作為測定波長，測定茶樣在420 nm的吸光值，每個樣品重復3次，取平均值，代入標準曲線計算白茶總黃酮含量。

1.2.3 ?化學計量法的選擇? 建立定量模型是近紅外光譜分析中較為重要的一步，對于組成復雜的天然產物如中藥、煙草、茶葉等通常可以使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）。PLS是基于因子分析的多變量校正方法，也是目前在近紅外光譜技術領域中應用最多的多元校正方法，因此，本研究引入PLS作為建模方法。

1.3 數據處理

本研究運用Omnic 8.2軟件進行數據格式的轉換，用Origin 2017軟件作圖，用TQ Analyst 8.0軟件進行光譜預處理和模型建立。

2? 結果與分析

2.1白茶近紅外光譜圖的采集

運用1.2.1的方法對91份白茶近紅外光譜進行采集，樣品近紅外光譜疊加結果如圖2所示。由圖2可知，不同等級和年份的白茶光譜圖雖然總體較為相似，但在高波長段的NIR吸收峰相對較強和尖銳，區分較為明顯，這是由于不同白茶的品質成分雖然大致相同但是含量有所區別，導致吸收峰和峰型的差異。

2.2總黃酮含量的測定

按照1.2.2測定91份白茶茶樣的總黃酮含量，結果如表2所示。由表2可知，不同等級白茶總黃酮含量區別較為明顯，壽眉總黃酮含量最高，其次是白牡丹，白毫銀針含量最低。說明白茶黃酮含量與等級有著密切關聯，等級越高，總黃酮含量越低。

采用PLS建立白茶總黃酮含量測定模型，運用TQ Analyst 8.0軟件對模型進行優化和驗證。從91份白茶樣品中隨機選取校正集和驗證集，一般選擇全部樣品的2/3至3/4作為模型的校正集，剩下的為驗證集，保證驗證集的波動范圍在校正集中，校正集和驗證集的含量分布如表3所示。

2.3光譜預處理方法的選擇

因為白茶茶樣的光譜相差不大，且受環境干擾較大，由檢測器檢測到的除了待測樣品的信息外，還有各種干擾，如高頻隨機噪聲、基線漂移、樣品背景等，為了建立更加準確、精度更高的模型，需要采用相應的方法對光譜進行處理^[22]。由于磨碎后的茶葉粉末顆粒大小、均勻性不同，光程無法保持恒定，一般選用多元信號修正（multip?l?i??c?ative signal correction，MSC）或標準正則變換

（standard normal variate，SNV）進行處理。此外還可以選擇原始光譜，一階導數光譜（first deriv?at??ive，FD）或者二階導數（second derivative，SD）進行光譜處理，一階導數光譜能顯示肩峰和吸收峰，而二階導數光譜可以找出兩者的準確位置。近紅外光譜測定過程中，經常出現光譜飄移，通過導數處理一方面可以消除基線偏移，還可以放大和分離重疊信息。但是在導數處理過程中，噪聲信號也被放大，因此，一般在積分處理前需要對光譜數據進行平滑處理。在TQ analyst 8.0軟件中平滑處理方法為SG（Savitzky-Golay）平滑法與ND（Norris-derivative）平滑法，經過平滑處理后的光譜信噪比和穩定性都有了提高。以相關系數（R）、校正均方差（RESEC）、預測均方差（RESEP）為評判指標。R越接近1，白茶總黃酮含量的真實值和預測值越接近，相關性越好。RESEC和RESEP越接近0，則模型準確性越好。

通過比較不同的光譜預處理方法，最終得到的光譜經過SNV+SD+SG處理后建模效果最高，相關系數和校正均方差和驗證均方差最接近最優值，不同預處理的結果如表4所示。

2.4? 建模波段的選擇

不同光譜區所包含的信息不同，光譜范圍的選擇是建立模型較為重要的一步。在近紅外區域，光的散射效應和吸收強度隨著波長而增加，而峰寬和穿透深度則相反，選擇最適合的光譜區域需要考察近紅外區域的光譜特征和白茶樣品的物理性質等。由圖3可知，10 000～8 000 cm^–1光譜較為平滑，不同物質在此波段吸收峰差異較小，包含的信息較少，而8 000～4 000 cm^–1區間內近紅外光譜信息豐富，在此范圍內有較多的可用價值。本研究采用SNV+SD+SG光譜預處理的方法建立模型，通過反復對比研究，以R和RESEC為參考內容，最終選用8 000～4 000 cm^–1光譜區域進行研究。

2.5? 主成分數的選擇

主成分數的選擇影響了模型的穩定性和準確性。本研究以交叉驗證均方根誤差（RMSECV）為判別標準，通過表5可知，當主成分數為14時，RMSECV的數值達到最小值，即0.261 96。因此，在本研究中，選擇最優的主成分數為14。

2.6? 異常樣本的剔除

樣品光譜或測定數據與真實值偏差太多視為異常樣品，樣品值異常可能為實驗方法不當、樣品存儲不當或操作過程出現失誤等原因導致。光譜異常可能是近紅外光譜儀異常、環境變動和人為操作不當等原因導致。

91個白茶樣品的總黃酮含量最大值為8.86 mg/g，最小值為1.72 mg/g，范圍較廣，覆蓋了多年份、多等級的白茶，樣本具有較好的代表性。本研究采用Dixon檢驗和光譜杠桿值與學生殘差T檢驗的方法進行異常樣本的剔除。

在化學計量學中，可以使用Dixon檢驗法對事先不知道測定值的均值和標準偏差，且測量得到的數據又服從正態分布的樣品集進行異常樣品的剔除。首先，將原始光譜信息通過主成分分析，減少其內部變量的含量（k<n），得到的新變量不僅保存了大部分原始信息且互不相關。通過主成分分析得到的k個新變量來計算實驗樣品光譜的馬氏距離。樣品光譜與樣品集平均光譜之間的距離即為馬氏距離，將得到的馬氏距離通過Dixon檢驗法進行異常樣品的剔除。將樣本的馬氏距離按照從低到高的順序排列，圖4顯示并沒有異常樣品。