哈茨木霉菌毒素與世高對桑葚核地杖菌抑菌活性的生物測定

余丹 黃宇 黃振

摘 要 核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）是桑葚白果病的主要病原菌之一，為害桑葚引起“白果病”。本文研究了哈茨木霉菌與世高單劑及混合物防治核地杖菌的潛力。研究結果表明：哈茨木霉的乙醇提取物（毒素）對核地杖菌菌絲生長和孢子萌發的抑制率分別為70%和80%以上，在室內條件下哈茨木霉毒素與世高對核地杖菌菌絲生長抑制的EC50分別為5.97、19.73 μg/mL。哈茨木霉與世高混合物對核地杖菌的抑制效果與混合物中兩種單劑的含量有關，混合物T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） 和 T6（6.0+14.0）處理組對核地杖菌的抑制效果表現為增效作用；從對病原菌的抑制效果、使用成本與化學農藥使用量等方面考慮，混合物T5是用于防治核地杖菌的最佳組合。本研究結果可為使用哈茨木霉毒素及其與世高聯合防治桑葚白果病提供參考。

關鍵詞 哈茨木霉；核地杖菌；世高；生物測定；孢子萌發抑制；菌絲生長抑制

中圖分類號 S476 文獻標識碼 A

Abstract Scleromitrula shiraiana is one of the fungal pathogen that attacks mulberry fruits and causes disease named as “popcorn disease”. Trichoderma harzianum was evaluated for its efficiency to suppress plant pathogen S. shiraiana alone or combined with fungicide difenoconazole under laboratory conditions. The results showed that the ethanol extracts of T. harzianum caused high mycelial growth inhibition and germination inhibition of S. shiraiana， with the inhibition value up to 70% and 80%， respectively. The EC50 of the ethanol extracts of T. harzianum or difenoconazole in mycelial growth inhibition of S. shiraiana was 5.97 μg/mL or 19.73 μg/mL under laboratory condition， respectiviely. The level of synergism between the ethanol extract and difenoconazole was affected by the concentration of each component in the mixtures. The synergistic effects were observed in treatments T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） and T6（6.0+14.0）， respectively. The treatment T5（6.0+7.0） was determined as the best additive effects according to the inhibition， Me and Chi-square values， also the cost and reduce use of fungicides. The current research on the joint action of the ethanol extracts from T. harzianum with difenoconazole offered a promising， safe and effective alternative to fungicides in treatment against S. shiraiana， popcorn disease of mulberry.

Key words Trichoderma harzianum； Scleromitrula shiraiana； difenoconazole； bioassay； mycelial growth inhibition； germination inhibition

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.024

桑椹白果病是桑椹菌核病的俗稱，又稱桑白果病，屬真菌類病害，是桑果上的主要病害，其病原菌主要有6種：桑實杯盤菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、聚杯盤菌（Synciboria ningpoensis）、茜草生核地杖菌（Scleromitrula rubicola）[1-5]。核地杖菌等白果病病原菌主要侵染桑樹的花，或在葉片的表面存活一段時間，但極少能侵染桑樹的葉片和

莖[3-4]。白果病病原菌的孢子附著到桑椹的花器上，隨后萌發、侵入子房內，入侵的菌絲在未成熟的桑果中迅速生長、大量增殖，最后菌絲在桑果中形成菌核，導致桑果呈白色、俗稱“白果”。桑椹白果病在世界各地均有分布，我國的廣東、浙江、江蘇、安徽、上海、陜西等地均有該病發生為害的報道[1-2]。桑椹白果病輕則影響桑葚的產量與品質，重則致使桑果無法正常成熟收獲，導致桑葚大面積減產，甚至顆粒無收，帶病菌和農藥殘留的桑葉又嚴重威脅蠶繭的生產，直接影響桑椹加工產業與蠶業生產所需的原料來源，威脅到桑果產業的持續發展。桑椹白果病的防治目前主要采用農業綜合防治和化學防治。國內外多年的田間實踐表明，化學農藥不能持續有效地控制白果病的大面積爆發危害[6-7]，同時會導致蠶桑產品的農藥殘留。開展桑椹白果病的生物防治有利于保護蠶桑產業的原料和產地的生態環境，采用以微生物源農藥等為主的生物防治措施能持續、有效地控制白果病的發生為害。

木霉菌（Trichoderma sp.）廣泛存在于不同類型的土壤中，是一種重要的植物病原生防真菌，其中哈茨木霉菌（T. harzianum）是白絹病、立枯病、疫病等多種植物病原菌的寄生菌和拮抗菌[8-9]。哈茨木霉菌主要通過重寄生作用、抗生作用、營養和空間的競爭、誘導植物產生抗性等多種方式來抑制植物病原真菌的為害[9-11]。哈茨木霉分泌的次生代謝產物可通過有效地破壞病原菌的細胞膜、使病原菌的原生質濃縮等抑制病原菌生長[11-13]。次級代謝產物中的小分子量、易揮發性非極性物質，如簡單的芳香族化合物、丁烯酸內酯類和吡喃酮類聚酮化合物、揮發性的萜烯類、異腈等能在土壤中移動，可有效抑制土壤中的病原菌；另一類大分子、高分子量的極性物質，如木霉素（trichodermin）、peptaibols物質等[13-14]對白絹病、立枯病等有較強的抑制作用，其中木霉素對水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucmeris）和黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長有顯著的抑制作用[15-16]。盡管有關哈茨木霉菌代謝產物的殺菌機制及利用代謝產物防治水稻等作物病害方面已有研究報道，但利用哈茨木霉毒素防治桑椹白果病方面的研究未見報道。

在前期研究哈茨木霉毒素的過程中發現，該毒素能有效地抑制白果病病原菌的生長。因此，本研究主要評估哈茨木霉粗毒素及其與世高混合物對核地杖菌的孢子萌發、菌絲生長的抑制作用，為利用哈茨木霉菌及其代謝產物防治桑葚白果病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和試劑 供試菌株為哈茨木霉菌（T. harzianum）菌株Th-N5（保藏號為CCTCC No：M2016251），分離于廣州地區被自然侵染的桑葚白果上。核地杖菌（S. shiraiana）Ss-05菌株分離于廣州地區被自然侵染的桑葚白果上，保藏于華南農業大學農學院昆蟲病原真菌實驗室。核地杖菌的鑒定參考White等[17]的方法，以基因組DNA為模板用ITS1/ITS4為引物（引物序列為5-TCCGTAGGGTGAACCTGCGG-3 / 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）擴增其特異的ITS序列，在GenBank中比對序列以鑒定菌株。哈茨木霉菌和核地杖菌均在PDA培養基上分別于（26±1）、（20±1）℃培養，待產孢后用0.1%的吐溫-80水溶液洗下孢子，用血球計數板將孢子液濃度分別調整到1×106、1×103個孢子/mL的備用。

試驗所用的世高為市售的苯醚甲環唑原藥（先正達投資有限公司生產）。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL。

固體發酵培養基： 麩皮 ： 玉米粉 = 3.5 ： 1（w/w），蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，硫酸銨2.0%，硫酸鎂1.0%，氯化鈣0.5%。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉毒素的提取 將配制好的固體發酵培養基加水拌勻后裝入三角瓶，在121 ℃下滅菌 30 min，冷卻后每瓶接種 l～3 mL孢子液，（25±1）℃恒溫培養 4 d后向固體發酵產物中分別加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等4種有機溶劑，超聲波處理 30 min，浸泡 2 d后過濾，獲得分別由4種有機溶劑萃取的提取物（真菌毒素），將提取物減壓濃縮獲得哈茨木霉毒素。

1.2.2 哈茨木霉毒素抑制核地杖菌孢子萌發和菌絲生長的生物測定 向PDA培養基中分別加入1.2.1中經4種有機溶劑提取的哈茨木霉毒素，制備成毒素濃度為10 ?g/mL的PDA固體平板培養基；將濃度為1×103個孢子/mL的核地杖菌孢子懸浮液30 ?L涂布于含毒素的PDA平板上，以不含粗毒素的PDA平板為對照，在20 ℃培養并觀察產生的菌落，記錄固體平板上的菌落數。每個處理各20個平板，每個處理3次重復。孢子萌發抑制率=[（對照區的菌落數 - 毒素處理區的菌落數） /對照區的菌落數] ×100%。將乙醇提取的毒素加入PDA培養基中配制成濃度為1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固體平板，取30 ?L濃度為1×103孢子/mL的核地杖菌孢子懸浮液涂布于含不同濃度毒素的PDA平板上，在20 ℃培養、觀察平板上的菌落，以不含毒素的PDA平板為對照，每日定時記錄平板上長出的菌落數。每個處理3次重復。研究中所用核地杖菌孢子在不含毒素條件下的孢子萌發率均高于93%。

將核地杖菌的孢子懸浮液涂布于PDA平板上，在20 ℃培養至產生菌絲，選取菌絲生長均勻的地方打孔獲得菌絲塊（? 5 mm）。將乙醇提取的毒素加入PDA培養基中配制成濃度為1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固體平板，在平板中央接入核地杖菌的菌絲塊，以不含毒素的PDA平板為對照，在20 ℃培養。采用十字交叉法，每天定時測量菌落的直徑。每個處理重復3次。菌絲生長抑制率= [（對照區菌落直徑-處理區的菌落直徑）/對照區菌落半徑] ×100%。

1.2.3 世高抑制核地杖菌孢子萌發和菌絲生長的生物測定 將世高加入PDA培養基中配制成濃度為3、6、12、24、48 ?g/mL的固體平板，采用1.2.2的方法測定世高對核地杖菌孢子萌發和菌絲生長的抑制率，每個處理重復3次。

1.2.4 哈茨木霉毒素與世高的混合物抑制核地杖菌孢子萌發和菌絲生長的生物測定 根據前面的測定結果，將哈茨木霉毒素與世高按不同比例混合，哈茨木霉毒素（乙醇提取物，?g/mL）與世高（?g/mL）的終濃度分別為T1（3+0） 、T2（6+0） 、T3（3+7） 、T4（3+14）、T5（6+7） 、T6（ 6+14）、T7 （0+7）、T8（0+14）。再將混合物加入PDA培養基中配制成固體平板，采用1.2.2 的方法測定不同濃度的混合物對核地杖菌孢子萌發和菌絲生長的抑制率，每個處理重復3次。

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