一株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗細菌的分離鑒定及其耐鋁特性研究

李怡 彭文濤 李勤奮 鄧曉 吳東明 譚華東 武春媛

摘 要 從甜瓜根際酸性土壤中分離篩選到1株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2。根據表型、生理生化特征和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為Pseudomonas sp.。菌株A2對甜瓜枯萎病病原菌的相對防效為68.3%，且拮抗能力具有遺傳穩定性。相比AlCl3處理，菌株A2對Al2（SO4）3表現出了更好的耐受性，最高可耐受Al3+ 50 mmol/L。在含有A13+的S-LB培養基中，菌株最適生長溫度為30 ℃；培養基初始pH值的降低會加劇A13+對菌株A2的毒害作用。研究結果為含活性鋁的酸性土壤中甜瓜枯萎病的生物防治提供優良菌株資源和理論基礎。

關鍵詞 耐鋁；細菌；甜瓜枯萎病拮抗菌；耐鋁能力；耐鋁特性

中圖分類號 S154.3 文獻標識碼 A

Isolation， Identification of An Aluminum-tolerant Bacteria Strain Antagonizing Fusarium Wilt of Muskmelon and Its Al-tolerant Characteristics

LI Yi1，2， PENG Wentao1， LI Qinfen1，2， Deng Xiao1，2， Wu Dongming1，2， Tan Huadong1，2， Wu Chunyuan1，2*

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Experiment Station of Agricultural Environment Scientific Observation in Danzhou， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An aluminum-tolerant bacteria strain antagonizing fusarium wilt of muskmelon， A2， was isolated from the rhizospheric soils of muskmelon. Based on the phenotypic， physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences， it was identified as Pseudomonas sp.. A2 showed strong antagonistic effect against Fusarium oxysporum and its relative control effect was 68.3%. A2 showed higher tolerant ability for Al2（SO4）3 than AlCl3， and it was tolerant to 50 mmol/L Al3+. The optimal temperature for the growth of A2 in medium containing Al3+ was 30 ℃， and the decreasing initial pH of the medium aggravated the toxic effect of A13+ on strain A2. This study would provide a new resource and theoretical basis for the biocontrol of fusarium wilt of muskmelon in acid and aluminum soils.

Key words aluminum-tolerance； bacteria； bacterium antagonizing fusarium wilt of muskmelon； Al-tolerant ability； Al-tolerant characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.021

我國酸性土壤遍布南方15個省市，總面積達2.03×108 hm2，約占全國耕地面積的21%[1]。酸性土壤中，活性鋁易以離子態釋放到土壤中，對植物、微生物具有非常大的毒害作用[2-3]。在酸性土壤中，鋁毒導致鉀、鈣等營養元素缺乏；鋁易在根中大量積累，干擾植物養分的吸收及運輸，是限制植物生長的主要因子之一[4]。鋁作用于微生物細胞的細胞壁、細胞膜、細胞核和多種細胞器，影響微生物的物質和能量代謝，抑制微生物的生長和發育。土壤中的富鋁化作用隨著酸性沉降及酸性肥料的大量施入而加劇，環境中活性鋁的數量呈明顯增加的趨勢[5]。

微生物具有生長快、易變異等特點。經鋁毒脅迫后而存活的土壤微生物，其解鋁毒能力是決定鋁毒危害程度的重要因素[6]。細菌在微生物中所占比例最大，與真菌相比，具有易培養、生長速度快、遺傳背景相對簡單等特點。耐鋁微生物，尤其是耐鋁細菌，可為耐鋁機制研究提供合適的模式生物體，為耗時較長的植物耐鋁新品種培育提供理論基礎。

甜瓜是我國的重要水果作物，但在酸性土壤中受鋁毒害嚴重，易發生甜瓜枯萎病。甜瓜枯萎病是由甜瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）引起的土傳病害，被稱為瓜類作物的“癌癥”。土壤中一旦存在甜瓜枯萎病菌將很難被根除，在連作地上表現尤為明顯[7]。目前，生物防治為甜瓜枯萎病的主要防治手段。生物防治是利用生物的代謝產物或生物體本身來拮抗病原菌，來源一般為自然界本身，對環境和人類安全無害，但須通過人為定量添加生防菌株至土壤中使其增殖，生防菌株在施用后普遍因不適應土壤環境而定殖能力不強，導致應用時防治效果較差。因此，鋁毒土壤中甜瓜枯萎病拮抗菌的定殖能力，成為關系甜瓜產量的重要因素。

甜瓜枯萎病拮抗菌的分離篩選已有研究報道，菌株種類包括木霉菌屬[8]、放線菌[9]、芽孢桿菌屬[10-11]等。生防菌株要具備耐鋁特性，才可成功應用于有鋁毒的酸性土壤，但國內外目前均無報道表明生防菌株具有耐鋁特性。本研究針對甜瓜大部分生長環境為鋁毒土壤，鋁脅迫較嚴重，易感染甜瓜枯萎病，且拮抗菌在鋁毒土壤中定殖能力較低、生物防治效果不理想的實際情況，試圖從土壤中分離出耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，研究其耐鋁特性，為提高生防菌株在原位條件下的耐鋁效果及定殖能力提供新的資源和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品，取自海南澄邁甜瓜根際磚紅壤，采集地表5～15 cm土壤，pH值為5.13。

甜瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）FJAT-9230，來源于福建省農業科學院農業生物資源研究所農業微生物研究中心。

50 %多菌靈可濕性粉劑，購自江蘇揚農化工有限公司。

Pseudomonas azotoformans DSM 18862，購自德國微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 耐鋁甜瓜枯萎病細菌的分離篩選及拮抗指數、遺傳穩定性、相對防效的測定 參照小西茂毅等的方法配制S-LB培養基[12]。在90 mL含20 mmol/L Al3+、pH 5.0的S-LB液體加10 g土壤樣品，于30 ℃、180 r/min振蕩培養24 h，梯度稀釋后涂布于固體S-LB 培養基上，30 ℃培養5 d，待平板出現單菌落后，挑取菌落形態不同的單菌落在S-LB培養基平板上劃線純化，直至單菌落形態一致且細胞染色在顯微鏡下觀察形態一致。

將篩選到的耐鋁細菌，參照鄒立飛[13]的方法，稍加改進，進行平板對峙、繼代培養、相對防效測定試驗。

平板對峙試驗：以甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230為指示菌，將病原菌活化后，用孔徑5 mm 的打孔器制成菌餅，取1塊菌餅到PDA 平板中央，將待測菌株點接于距平板中心25 mm處的4個點上， 30 ℃培養5 d后，測定該PDA培養基中上述菌株的抑菌圈半徑、拮抗菌半徑，計算拮抗指數。

抑菌圈半徑=拮抗菌菌餅中心至病原菌菌絲邊緣的距離

拮抗指數=（抑菌圈半徑﹣拮抗菌半徑）/拮抗菌半徑。

繼代培養試驗：將菌株連續傳代，逐代進行平板對峙試驗，計算拮抗指數，確定菌株抑菌活性的穩定性。

相對防效測定：盆栽土壤為磚紅壤，pH值為4.98。將病原菌FJAT-9230制成孢子懸浮液（濃度為1×106 cfu/mL），拮抗菌制成1×108 cfu/mL菌懸液，甜瓜（金輝1號）緩苗后，接種拮抗菌株和病原菌液，二者接菌量為10 mL，以只接種病原菌、清水和50%多菌靈可濕性粉劑500倍液作為陰性和陽性對照，每個處理10盆，每盆1株甜瓜苗，3次重復。7 d后觀察發病情況，15 d后計算發病指數和相對防效。

甜瓜苗期枯萎病分級標準[14]：0級，莖基部無褐變；1級，莖基部褐變；2級，莖基部1/2處褐變；3級，莖基部2/3處以上褐變；4級，莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死。

病情指數=[Σ（病級株數×病害級數）/（該處理盆栽苗總和×發病最重級的代表數值）]×100。

相對防治效果=[（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數] ×100%。

1.2.2 菌株形態觀察、生理生化特征的確定及分類地位分析 菌株菌落形態、生理生化特征的確定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[15]和《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》[16]。

菌體總DNA的提取方法為改良CTAB法 [17-18]。

菌株16S rRNA基因的PCR擴增以其基因組DNA為模板，采用通用引物。正向引物為5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-TACCTTGT TACGACTT-3′[19]。

擴增體系（50 μL）如下：10×Buffer 5.0 μL，Mg2+（25 mmol/L） 4.0 μL，dNTP（10 mmol/L）

5.0 μL，正向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，反向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，菌株基因組DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，滅菌雙蒸水

至50 μL。

PCR擴增反應程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，

56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個循環；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR產物通過1%，GoldView染色的瓊脂糖電泳后，凝膠成像儀檢測。用DNA凝膠回收試劑盒回收基因片段，TA克隆后進行測序（由華大基因完成）。根據16S rRNA 基因的測序結果，在http：// eztaxon-e.ezbiocloud.net/下載同源性較高的16S rRNA基因序列[20]，用MEGA version 5.0 軟件采用鄰接法[21]構建降解菌株的 16S rRNA基因系統發育進化樹[22]。

1.2.3 不同形態Al3+處理對菌株生長的影響 參照王超等[23]的方法，稍加改動。將不同形態的Al3+[AlCl3、Al2（SO4）3]滅菌后加入S-LB培養基中，Al3+終濃度為30 mmol/L。將菌株用不加Al3+的S-LB培養至OD600=0.5，以2%接種量接種于含不同形態Al3+的S-LB中，于30 ℃、160 r/min培養72 h，定時取樣，測定OD600，以菌株在不含Al3+的S-LB培養基上的生長情況作為對照，每個處理做3個重復，繪制菌株在含有不同形態Al3+的S-LB培養基中的生長曲線。

1.2.4 菌株耐鋁能力分析 菌株耐鋁能力的測定采用點接法。制備菌液，離心，無菌蒸餾水洗滌2 次后重新懸于1 mL 無菌蒸餾水中，調至OD600值為0.5。將重懸后的菌液再稀釋10、100倍后，各取3 μL點涂于含不同濃度（0、10、30、50、60 mmol/L）Al3+[[Al2（SO4）3]的固體S-LB培養基上，30 ℃培養，以分類地位較為接近的Pseudomonas azotoformans DSM 18862作為對照，3 d 后觀察培養結果。

1.2.5 pH對菌株在Al3+中生長的影響 設置S-LB培養基（含30 mmol/L Al3+）的pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，以無菌水調節菌懸液濃度至OD600=0.5，2%接種量，分別接種于上述培養基中，30 ℃培養3 d，以菌株在不加Al3+的各pH值培養基的生長情況作為對照，每個處理做3個重復，測定菌株OD600。

1.2.6 溫度對菌株在Al3+中生長的影響 在S-LB培養基中加入Al3+，其終濃度為30 mmol/L，pH 5.0，無菌水洗菌，調至OD600=0.5，2%接種量，分別于不同的培養溫度下（20、25、30、35、40 ℃）培養3 d，每個處理做3個重復，測定菌株OD600。

1.2.7 陽離子對菌株生長的影響 參照王超等[23]的方法，稍加改動。在pH 5.0的S-LB培養基中分別加入Na2SO4、K2SO4、MgSO4、Al2（SO4）3 ，使各陽離子的終濃度分別為90、90、45、30 mmol/L。將OD600值為0.5的菌液以2%接種量加入，以菌株在不含任何陽離子的S-LB培養基上的生長情況作為對照，30 ℃培養3 d，每個處理做3個重復，測定菌株OD600。

2 結果與分析

2.1 耐鋁甜瓜枯萎病細菌的分離篩選及拮抗指數、遺傳穩定性、相對防效的測定

從甜瓜根際土壤中分離到一株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2。菌株與病原菌平板對峙效果見圖1。結果表明，病原菌向拮抗菌株生長到一定程度即停止生長，有明顯的抑菌帶出現，病原菌菌絲發黑。

A：對照病原菌；B：平板對峙效果。

A： Fusarium oxysporum FJAT-9230； B： the result of pair culture.

菌株A2初代拮抗指數為2.03±0.14，轉接至20代時，仍對甜瓜枯萎病病原菌有明顯的拮抗效果，拮抗指數為1.87±0.22，與初代培養相比無明顯差別。說明菌株對病原菌的拮抗效果持久有效，有較好的遺傳穩定性。

對病原菌的防效結果見表1。由表1可知，施用A2菌液處理后，病情指數明顯低于清水對照，表明菌株A2對甜瓜枯萎病病原菌具有良好防效（68.3%），與多菌靈處理的防治效果（72.1%）相當。

2.2 菌株形態觀察、生理生化特征的確定及分類地位分析

對菌株A2的菌落及菌體形態進行觀察，結果表明，在S-LB平板上，菌株A2的菌落呈圓形，乳白色，光滑（圖2-A）；在透射顯微鏡下觀察，該菌為桿狀，有極生鞭毛，無芽孢（圖2-B）。

A： 菌株A2菌落形態照片； B： 菌株A2透射電鏡照片。

生理生化特征測定結果表明，該菌為革蘭氏陰性菌，可利用D-葡萄糖、D-甘露糖醇、L-阿拉伯糖、肌醇為碳源生長，硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶、細胞色素氧化酶試驗為陽性，吲哚產生試驗為陰性。

菌株A2的16S rRNA基因系統發育樹見圖3。結果表明菌株A2與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）有較高的同源性，在系統發育樹上與Pseudomonas paralactis WS4992 的16S rRNA基因相似性最高，為99.44%，與Pseudomonas antarctica CMS 35 的16S rRNA基因相似性最低，為98.35 %；并且和Pseudomonas lactis、Pseudomonas azotoformans聚類在一個亞分支上。結合其生理生化特征及16S rRNA基因序列分析結果，將菌株A2鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.3 不同形態Al3+對菌株生長的影響

由于各種Al3+形態在水中的溶解度不同，本研究選取溶解度較好的AlCl3、Al2（SO4）3中2種形態的Al3+作為代表，研究其對菌株A2生長的影響，結果如圖4。結果表明，2種形態的Al3+濃度為30 mmol/L時，與不加Al3+的對照相比，菌株A2的生長受到一定抑制；但相比AlCl3處理，在Al2（SO4）3處理中，菌株A2進入對數期的時間較早，且生長速率較快，菌株A2對Al2（SO4）3表現出了更好的耐受性。因此選取Al2（SO4）3中的Al3+作為后續的處理形態。

2.4 菌株耐鋁能力分析

通過觀察不同濃度的A2菌液在不同Al3+濃度S-LB培養基中的生長情況，對菌株A2的耐鋁能力進行初步分析，結果見表2。

結果表明，Al3+濃度為10 mmol/L時，不耐鋁的對照菌株已停止生長，但菌株A2的生長并未受到抑制，與不加Al3+的處理相比，沒有明顯的區別。隨著Al3+濃度增大，菌株的生長逐漸受到抑制。當Al3+濃度為50 mmol/L時，菌液稀釋100倍點接的菌株A2已停止生長，菌液未稀釋的和稀釋10倍點接的菌株A2仍然可以生長，但與不加Al3+和低濃度Al3+處理相比，生長受到明顯抑制，說明50 mmol/LAl3+已對菌株A2產生毒性。綜上所述，細菌A2可耐受50 mmol/L的Al3+，具有良好的耐鋁能力。

2.5 pH值對菌株在Al3+中生長的影響

當pH值小于5時，活性鋁主要以A13+形式存在，而當pH值超過6.0時，鋁離子易生成氫氧化鋁，出現絮狀沉淀，所以研究pH≤5.0時，菌株A2在Al3+中的生長情況。結果見圖5。結果表明，A13+存在條件下，pH值的變化對菌株生長有顯著影響。pH值降低至4.0以下、Al3+濃度為30 mmol/L時，菌株的生長完全受到抑制。菌株在不加A13+的各個pH培養基中的OD600均大于有A13+的相應處理的數值。在無A13+條件下，菌株可在pH 3.0的S-LB培養基中生長，可見，酸性條件會顯著加劇A13+對菌株A2的毒害作用。

同pH環境不同小寫字母表明不同處理在0.05水平上存在顯著差異。

Different lower-case letters in the same pH condition indicated significant differences at the 0.05 level.

2.6 溫度對菌株在Al3+中生長的影響

溫度對菌株A2在Al3+中生長的影響見圖6。結果表明，A13+存在條件下，菌株在25～35 ℃條件下生長情況較好，在20～25 ℃和35～40 ℃范圍內OD600值較小，當溫度達到40 ℃時，菌株生長幾乎停止。菌株A2最適生長溫度為30 ℃。

2.7 陽離子對菌株生長的影響

研究同等正電荷量的不同陽離子對菌株A2生長的影響，結果見圖7。結果表明，與不加任何陽離子處理的空白對照相比，同等電荷量的Na+、K+、Mg2+并未對菌株A2生長產生抑制，而高濃度A13+顯著抑制了菌株生長。這表明A13+對菌株A2產生細胞毒性，主要原因并不是離子強度過高致使細胞質濃度降低、滲透勢升高，細胞滲透調節失敗。

3 討論

在A13+易于對生物產生毒性、耐鋁細菌難以篩選[24]、細菌的耐鋁機制研究進展緩慢的前提下，本研究篩選到了一株耐鋁細菌A2。以分子操作相對簡單但研究成果較少的細菌，進行耐受性相關的基因組學和蛋白質組學研究，將成為今后揭示生物耐鋁機制的重要手段。菌株A2可作為研究耐鋁機制的良好對象。

甜瓜枯萎病主要利用生物手段防治，但拮抗菌因不具有耐鋁特性，定殖能力低，無法在鋁毒土壤中起作用；而甜瓜根際土壤中分離得到的耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，可能對甜瓜耐鋁具有重要作用。綜上所述，同時具有高效耐鋁及防治甜瓜枯萎病兩種功能的菌株A2，作為研究材料具有唯一性，可能在鋁毒土壤中具有較高的定殖能力，能夠更好的應用于鋁毒嚴重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治。菌株A2進行連續傳代后，仍能保持較高的拮抗指數，其拮抗能力的遺傳穩定性有利于菌株在較長時間內對甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230起到抑制作用。研究結果表明，菌株A2可延遲發病時間，延緩病害發展速度。

王超等[23]研究發現，紅酵母RS1對Al2（SO4）3 的忍耐能力高于AlCl3。本研究考察了Al3+形態對革蘭氏陰性細菌A2生長的影響，結果表明菌株A2亦對Al2（SO4）3表現出了更好的耐受性，Al3+形態對菌株生長有顯著影響。耐鋁能力測定結果表明，菌株A2對A13+并無依賴性，較低濃度的A13+并不能促進菌株的生長。本研究中還發現，培養基初始pH下降會加劇A13+對菌株A2的毒害作用，與Al3+存在著疊加效應。引起上述現象的原因，可能與菌株耐鋁的分子機制有關，仍需進一步研究。

本研究分離篩選到1株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2 ，經鑒定其為Pseudomonas sp.，A2最高可耐受50 mmol/LAl3+。對菌株A2防效及其拮抗能力的遺傳穩定性、耐鋁特性進行了研究。研究結果可為鋁毒嚴重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治提供優質菌株資源和理論依據。

參 考 文 獻

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