茉莉酸甲酯重復刺激對白木香所結沉香中沉香四醇含量的研究

江浩 王祝年 羊青 王清隆 王茂媛

摘 要 利用茉莉酸甲酯，重復刺激誘導白木香結香，提高所結沉香中沉香四醇的含量。白木香經鋸傷、及3種濃度（0、10、50 g/L）茉莉酸甲酯重復刺激（僅1次、1次/月、2次/月、4次/月）誘導結香，時長6個月，HPLC法測定所結沉香中沉香四醇的含量。結果表明：10 g/L茉莉酸甲酯2次/月刺激誘導白木香所結沉香中沉香四醇含量最高，為1.78 mg/g。由此可知，利用植物激素茉莉酸甲酯誘導、重復刺激均能明顯提高白木香所結沉香中沉香四醇的含量。

關鍵詞 白木香；結香；茉莉酸甲酯；刺激；沉香四醇

中圖分類號 R284 文獻標識碼 A

Abstract Methyl jasmonate was used to stimulate repeatedly Aquilaria sinensis to form agarwood which has high content of agarotetrol. Agarwood was induced by sawing or three concentrations （0， 10， 50 g/L） of methyl jasmonate， then repetitive stimulation （only once， once per month， twice per month， 4 times per month） for 6 months. The HPLC method was used to determine the content of agarotetrol in the agarwood. The result showed that the content of agarotetrol in the agarwood of A. sinensis treated twice per month with 10 g/L of methyl jasmonate was the highest， 1.78 mg/g. In conclusion， phytohormone methyl jasmonate and repeated stimulation are beneficial to increasing the content of agarotetrol in the agarwood of A. sinensis.

Keywords Aquilaria sinensis； agarwood formation； methyl jasmonate； stimulation； agarotetrol

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.023

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria Lam.）和擬沉香屬（Gyrinops Gaertn.）植物中含有其自身分泌樹脂的干燥木材[1]，其性辛、苦，微溫，歸脾、胃、腎經，行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘[2]。白木香[Aquilaria sinensis （Loureiro）Sprengel]是國產沉香特有的結香樹種和唯一來源。隨著中藥現代化的快速發展和香客、收藏愛好者對沉香的熱衷，沉香的需求日益增加，野生資源和傳統的人工結香已經遠遠不能滿足需求，探索高效益的結香技術迫在眉睫[3-5]。如今，白木香人工栽培技術日漸成熟[6]，華南地區有大面積白木香栽培基地，如海南島的?？?、臨高、定安、樂東尖峰嶺以及昌江霸王嶺等地區，每年人工育苗可達幾百萬株[7]。

白木香正常生長，未受到任何刺激和創傷，木材內部無法產生樹脂。自然生長的白木香樹經過蟲蟻的啃食、病腐、風倒、雷擊和火燒等外來因素傷害之后，在受傷害部位細胞內部會出現棕黃色脂類物質，常年積累產生含脂量較高的沉香。茉莉酸類化合物調節植物的生長和發育，特別是作為內源傷害信號分子參與植物對生物脅迫（真菌或細菌侵染及昆蟲啃食）防御反應和對非生物脅迫（傷害、鹽脅迫、高溫、低溫、水淹、干旱等）逆境的應答[8]。張爭等[9]研究證明，傷害導致白木香防御反應中早期傷害信號內源茉莉酸類化合物含量升高，隨后倍半萜類防御物質含量增高，而外源茉莉酸甲酯的處理也能誘導白木香產生相同種類的倍半萜類物質且數量遠遠高于傷害。

對于白木香結香原理的研究，國內的學者多集中在真菌誘導白木香結香[10-11]，白木香葉、果實、莖等部位的化學成分研究[12-14]以及白木香結香樹脂部位主要成分研究[15-16]；國外學者多集中在沉香結香機制及主要成分的形成，如Kurosaki等[17]從小果沉香（A. microcarpa Baill.）細胞培養體系中分離到3個編碼倍半萜合酶基因，參與催化α-愈創木烯合成酶、δ-愈創木烯合成酶、β-欖香烯和α-蛇麻烯等倍半萜烯的生物合成；Azzarina等[18]從馬來沉香（A. malaccensis Lam.）中克隆得到倍半萜合酶編碼基因AmSesTPS1和δ-愈創木烯合酶編碼基因AmGuaiS1。目前，利用植物激素結合重復刺激誘導白木香結香的造香技術鮮有報道。本研究擬通過茉莉酸甲酯結合鑿洞法重復刺激誘導白木香結香，以期提高所結沉香中沉香四醇的含量，縮短結香時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 植物材料白木香來自海南省儋州國家農業科技園區基地10年生的健壯白木香樹（10棵，編號1～10），經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為瑞香科沉香屬白木香。

1.1.2 儀器與試劑 Agilent-1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；KQ-600DE型數控超聲波清洗器，昆侖超聲儀器有限公司；AE-240型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；ZORBAX 色譜柱XDB-C18，美國安捷倫公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

茉莉酸甲酯（MJ），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號MKBZ8786V；為減少茉莉酸甲酯的損失，另選醫用脫脂棉作為香門的填充體，脫脂棉在使用之前放入烘箱干燥處理；一次性無菌注射器（30 mL），購自江西益康醫療器械集團有限公司。沉香四醇對照品（批號：Z08J7X15899，純度≥98%），購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈（色譜純），購自美國Fisher公司，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 白木香刺激結香處理 在白木香樹干平整的表面上，距離地面50 cm處自下而上做8個標記，分別為A～H，相鄰2個標記相隔30 cm。

陽性對照（1～2號樹），用鋸子在樹體標記處鋸成深3 cm、長15 cm的傷痕（圖1-a）。陰性對照（3～4號樹）及實驗組（5～10號樹），用錘鑿刀等工具在樹體標記處開成寬×高×深為3 cm×3 cm× 7 cm的香門（圖1-b）。

1～2號樹體刺激時使用鋸子加深傷痕，達到重復傷害的效果；3～10號樹體給藥前用鑷子夾出脫脂棉，再用刀片清理香門，塞入2.5 g脫脂棉，注射器注射給藥20 mL，具體處理如表1所示。

1.2.2 試樣采集與預處理 選擇晴朗多云的天氣，在白木香刺激結香處理的第7個月月初采集樣品。為減少取樣對測試結果的影響和對植株的傷害，采用雙線法取樣，具體操作為：

用鑷子夾出脫脂棉，再用小刀片輕輕刮去香門周圍殘留的雜物；選定結香位置，用小刀在距香門上下1.2、3 cm處各劃出1條水平切割線（共4條），距香門左右1.5 cm處各劃出1條豎直切割線，深度達到木質部，去除韌皮部；用錘鑿刀等工具分別取出香門上下2條線之間含樹脂的（帶顏色）木材，65 ℃烘干，粉碎過60目篩備用。

1.2.3 沉香四醇的含量測定 取含樹脂部分木材（主要以顏色區分），去除白色部分，采用《中華人民共和國藥典》中的高效液相色譜法（通則0512）測定沉香中沉香四醇的含量[19]。

對照品溶液的制備：精確稱取一定量的沉香四醇對照品，加95%乙醇配制成60 ?g/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精確稱取沉香干燥粉末0.2 g，置具塞三角瓶，使用10 mL移液槍精確加入95%乙醇10 mL，記錄質量為m，靜置0.5 h后，通過超聲儀器不加熱處理（功率250 W，頻率40 kHz） 1 h，冷卻后，再確定其質量，用95%乙醇補充至m，并充分混合后靜置使其沉淀，取上清液過濾后作為供試品溶液。

色譜條件：流動相 A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，洗脫時間35 min；按表2設定的配比進行洗脫；柱溫為30 ℃；檢測波長為252 nm。理論塔板數按所測物質計算應高于6 000。每次進樣量10 μL。

1.2.4 方法學考察 線性關系考察：精確吸取一定量的對照品溶液，按差異性配比分別加入95%乙醇制成2、20、40、60、80、100、120 ?g/mL的對照品溶液。按順序精確吸取上述對照品溶液10 ?L進樣，以峰面積（y）對濃度（x，?g/mL）做標準曲線。

精密度試驗（RSD值小于2.0%）：精確吸取對照品溶液3 mL，置于10 mL棕褐色容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。連續進樣6次，記錄沉香四醇峰面積，并計算RSD。

穩定性試驗（RSD值小于2.0%）：精確稱取干燥樣品0.2 g，配制供試品溶液，常溫擱置，分別在同一天0、2、4、6、8、10、12、24 h準時進樣，記錄沉香四醇的峰面積，并計算RSD。

重復性試驗（RSD值小于2.0%）：精確稱取干燥樣品0.2 g，配制供試品溶液，進樣，記錄沉香四醇的峰面積，重復操作6次，并計算RSD。

回收率試驗：精確稱取干燥樣品0.2 g 6份，平均分為3組，每組分別加入沉香四醇對照品0.513 4、0.661 2、0.813 2 mg，配制供試品溶液，進樣，記錄沉香四醇的峰面積，并計算RSD；計算平均加樣回收率。

1.3 數據處理

使用WPS軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 木質部形態特征

將取好的含樹脂的木材擦干凈，觀察木材形態特征。由表3和圖2可知，陽性對照組沉香由鋸子鋸傷所形成，傷口表面全部結香，傷口顏色由內向外逐漸由黃加深，最外面黑褐色（由于長期裸露在外腐爛形成）。陰性對照組及實驗組沉香由鑿洞法結合藥劑處理形成，以洞為中心，呈橢圓形。形成方向以豎直為主，高度能達到11～ 15 cm；水平方向形成少，寬4～5 cm，長7～8 cm。傷口表面均為黑褐色，內部沉香顏色為黃色，黃褐色。

2.2 HPLC法分析沉香四醇含量

采用HPLC法分析沉香中沉香四醇的含量，圖3為對照品和樣品的液相色譜圖。方法學考察的結果表明，在2.0～120 ?g/mL范圍內，沉香四醇回歸方程y=29.502x+1.254 8，相關系數R2=0.999，線性關系良好。精密度試驗結果表明該設備有很好的精密性，相對標準偏差RSD為0.68%。穩定性試驗表明，常溫下供試品溶液在全天內有很好的穩定性，相對標準偏差RSD為1.03%。該方法重復性良好，相對標準偏差RSD為1.37%。平均加樣回收率為102.42%，RSD為1.02%，表明回收率很好，符合檢測方法要求。

2.3 茉莉酸甲酯對白木香誘導效果評價

根據《中華人民共和國藥典》[19]，以沉香 四醇為標準評價沉香品質，沉香四醇（C17H18O6）的含量應大于0.10%（以干燥樣品總量計算）。 因此，本研究中16種處理方式，其中5種處理 （10 g/L茉莉酸甲酯刺激1、2、4次/月及50 g/L茉莉酸甲酯刺激1、2次/月）所結沉香質量合格（表4）。

比較實驗組1、2與陽性對照白木香所結沉香中沉香四醇的含量可知，茉莉酸甲酯誘導白木香效果良好。其中實驗組1，給藥濃度為10 g/L茉莉酸甲酯乙醇溶液，刺激頻次2次/月所結沉香四醇含量最高，為1.78 mg/g，是對應陽性對照的14.8～ 21.8倍，有顯著提高沉香四醇含量的效果。

比較實驗組1與實驗組2沉香四醇含量，濃度為10 g/L的茉莉酸甲酯乙醇溶液誘導白木香所結沉香的沉香四醇的含量高于50 g/L濃度，表明茉莉酸甲酯的濃度與其誘導結香的沉香四醇含量不成正比。這可能與植物激素本身的性質有關，植物激素是由植物自身代謝產生的一類有機物質，并從產生部位移動到作用部位，在極低濃度下就有明顯生理效應的微量物質，也被稱為植物天然激素或植物內源激素[20]。

比較陰性對照與陽性對照及實驗組1、2沉香四醇含量，50%濃度的乙醇溶液對白木香結香也有一定的促進作用，可能與50%濃度的乙醇溶液對細胞的傷害誘導白木香結香，但沒有茉莉酸甲酯效果好。

2.4 刺激頻次對白木香誘導效果評價

比較4個處理組不同刺激頻次誘導白木香所結沉香的沉香四醇含量（表4）可知，重復刺激能明顯提高沉香四醇的含量，每月2次的刺激方式所結沉香中沉香四醇含量最高，是僅一次的2.8～3.4倍；3種重復刺激方式，2次/月最高，其次1次/月，4次/月最低。白木香結香是一個緩慢的過程，過于頻繁的傷害白木香可能造成了其“傷害疲勞”，擾亂了結香生理，反而不利于結香。

3 討論

本研究表明，白木香樹脂類物質不但可由傳統的物理創傷、真菌侵染等誘導產生，而且可由茉莉酸甲酯誘導產生，且與物理創傷法、真菌侵染法和通體結香法[21-23]相比，茉莉酸誘導結香效率更高，結香體積更大。茉莉酸甲酯通過白木香樹的木質部進入植株體內，在細胞質中被酯酶水解為茉莉酸，激活植株體內茉莉酸信號途徑，模擬物理創傷、真菌侵染等效果，最終達到白木香樹內脂類物質形成的目的[24]。因此，茉莉酸甲酯可能與白木香樹脂類物質的產生有關。當白木香樹遭受昆蟲取食和特定病原菌侵染時，植株體內茉莉酸、乙烯信號途徑會被激活，此信號途徑的末端產物會激活白木香體內編碼防御蛋白和某類特定基因的表達，隨后產生并積累棕黃色脂類物質這類次生代謝產物用于適應環境的脅迫。

近年來，越來越多的學者開始關注植物激素調控植物次生代謝的作用，而除了茉莉酸甲酯，其他如水楊酸、乙烯等對白木香結香品質的調控有待進一步研究；而多次給藥刺激這一方式有顯著提高沉香四醇含量的效果。但其機制尚未明確，對其他藥用植物有效成分的產量及品質是否有一定的提高，亦值得進一步研究。研究白木香的結香機理，探尋新型高效結香方法，對縮短結香時間，提高沉香的單位產量、結香品質，增加白木香林的經濟效益，緩解沉香供求關系以及保護和利用白木香資源都有著非常重要的意義。

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