高產葡萄糖酸黑曲霉菌株的誘變選育

白長勝 孟維珊

摘要：以一株產葡萄糖酸的黑曲霉為出發菌株，對其進行紫外線誘變處理，篩選得到一株產葡萄糖酸較高的菌株，產酸力比原始菌株提高了1. 16倍，經連續傳代7代，產酸性能未出現較大的差異，具有較好的遺傳穩定性。

關鍵詞：黑曲霉；葡萄糖酸；紫外線誘變；產酸能力

中圖分類號：TQ921.2

文獻標識碼：A

文章編號：2095-9737（2018）08-0001-02

葡萄糖酸及其衍生物（如葡萄糖酸鹽、葡萄糖酸δ- 內酯）作為蓬松劑、凝固劑、鰲合劑、酸味劑而廣泛應用于食品、化工、水處理、建材和醫藥等行業[1-2]。葡萄糖酸的生產方法包括發酵法、均相化學氧化法、電解氧化法和多相催化氧化法[3]。生物發酵法是當前國內生產葡萄糖酸最有競爭力的生產方法，具有發酵周期短、發酵過程易于控制、發酵液純度高、產品易于提取、設備要求低等優點。能發酵葡萄糖產生葡萄糖酸的微生物很多，工業上主要使用黑曲霉發酵生產葡萄糖酸[4-5]。

紫外線誘變是一種使用最早、沿用最久且應用效果明顯的誘變方法，該方法設備簡單、操作方便、成本低廉、誘變頻率高、誘變效果明顯，迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變方法之一。本研究以篩選到的產葡萄糖酸性能較高的黑曲霉為出發菌株，利用紫外線誘變處理原始菌株，篩選得到產酸能力高、遺傳性能穩定的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉YS由黑龍江省畜牧研究說微生物實驗室篩選并保藏。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基

葡萄糖60 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04.7H20 0.02 g/L，玉米漿l g/L，CaC035 g/L，瓊脂25 g/L，pH值6.5～7.O，121℃，滅菌15 min。

1.2.2 平板培養基

葡萄糖250 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04·7H20 0.02 g/L，玉米漿1 g/L，CaC03 10 g/L，瓊脂18 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。

1.2.3 種子培養基

葡萄糖240 g/L，尿素0.2 g/L，KH2 P040.64 g/L，玉米漿7.2 g/L，CaC03 10 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。

1.2.4 發酵培養基

葡萄糖300 g/L，尿素0.1g/L，KH2 P040.02 g/L，MgS04·7H20 0.2g/L，CaC03 40 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。1.3 試劑與儀器

試劑：葡萄糖，尿素，MgS04.7H20，KH2 P04，瓊脂，CaC03，甲醇，磷酸。

儀器：搖床，培養箱，超凈工作臺，高壓滅菌鍋，磁力攪拌器，血球計數板，顯微鏡，高效液相色譜儀，pH計。

1.4 方法

1.4.1 單孢子懸液制備

黑曲霉YS作為出發菌株，用無菌水5 mL沖洗下培養好的新鮮斜面孢子，用玻璃珠打散，脫脂棉過濾，制得單孢子懸浮液，取0.5 mL用無菌生理鹽水適當稀釋后用平板菌落計數法測菌懸液濃度[6]，調整孢子液濃度為每毫升l07～l08個孢子。

1.4.2 紫外誘變

取5 mL孢子懸液于直徑5 cm培養皿中，加入自制轉子，置于磁力攪拌器上，在15 W紫外燈下、距離30 cm分別照射不同時間，然后將處理液梯度稀釋后取104稀釋度菌懸液0.1 mL處理液涂布于分離培養基平板，35℃避光培養3～5天后，進行菌落計數。以未誘變菌液培養后的菌落數為基準計算不同誘變時間的致死率，繪制致死率曲線，確定誘變劑量并進行誘變。

致死率（%）=（對照皿的菌落總數誘變處理后的菌落總數）/對照皿的菌落總數×100%

1.4.3 突變株的篩選

初篩：將菌落周圍溶圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株挑至斜面上，純化后進行復篩發酵。

復篩：挑取活化后的菌種接種于裝有40 mL種子培養基的150 mL三角瓶中，38℃、200 r/min振蕩培養24 h，然后取5 mL轉接于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，38℃、300 r/min振蕩培養24 h，濾紙過濾后測定發酵液中葡萄糖酸的含量，以原始菌株YS產葡萄糖酸量作為對照，選取產酸量較高的菌株。

1.5 葡萄糖酸含量的測定

過濾后的發酵液稀釋100倍后，用HPLC測定葡萄糖酸含量。

HPLC檢測條件：色譜柱為Amethyst C18 H（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇：水：1%磷酸一50：450：500，流速1.O mL/min，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

1.6 菌株遺傳穩定性實驗

將誘變菌株連續傳代7代后，7代菌株同時進行發酵實驗，測定產酸量。

2 結果

2.1 紫外誘變劑量的選擇

采用紫外線誘變方法將菌懸液用紫外線分別照射o、0.55、l、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5 min后，通過平板菌落記數法計算致死率，繪制紫外照射致死率曲線，結果如圖l所示。

紫外照肘o.5 min的致死率為43. 3%，1 rmn的致死率為75. 8%，1.5 min的致死率為88. 7%，2 min的致死率為95. 2%，2.5 min的致死率為99.7%，照射3 min及以上的致死率為100%。根據誘變育種的產量變異中大多傾向于采用較低劑量的原則[7]，本試驗選取致死率為80%的誘變劑量，將紫外誘變紫外線照射的時間取為1.5 min。

2.2 紫外誘變篩選

紫外照射后的菌株涂布平板，初篩后共挑取117株，經搖瓶復篩測產算量，以YS產葡萄糖酸量為100%，產酸量提高的菌株有61株，但多數提高幅度不大，其中6株突變株的產酸能力提高到YS誘變前的1.1倍以上，結果見表l。

2.3 菌株的遺傳穩定性

以誘變后產酸量提高明顯的6株菌株為實驗菌種，在斜面上連續傳代7代，將所有代次菌株接種搖瓶發酵，測定產酸量，繪制突變株產酸穩定性曲線，結果如圖2。

Fig2 The stability of acid production by mutant strains

由圖2可知，而菌株UF13、UF35、UF62和UF74的產酸不夠穩定，隨著代數增加它們的產酸能力均有所下降。菌株UF20和UF107產酸性能基本穩定，表明二者遺傳穩定性良好。UF107的產酸性能優于UF20，因此選用菌株UF107作為以后發酵產酸的出發菌株。

3 討論

葡萄糖酸與碳酸鈣反應在平板上形成透明圈，本研究采用透明圈法作為初步判定菌株產酸能力強弱的依據。一般認為透明圈直徑比與產酸量呈現正相關性。透明圈越大，產酸越多；透明圈出現得越早，產酸越快，在實驗中篩選得到的多數突變菌株產酸能力符合這種正相關性。采用這種初篩方法大大提高了篩選效率。

本試驗通過紫外線誘變處理黑曲霉原始菌株YS，最終篩選得到一株產葡萄糖酸能力提高且性狀穩定的菌株UF107，產酸力是原始菌株1.16倍。

參考文獻：

[1]謝冬梅，韋禮寧，周朝暉，等，葡萄糖酸系列產品的研制[J].廣西化工，2000，9（1）：17-19.

[2] SUMITRA RAMACHANDRAN， PIERRE FONTANILLE，ASHOK PANDEY. Gluconic Acid： Properties， Applicationsand Microbial Production[J]. Biotechnol， 2006， 442： 185- 195.

[3]郭鳳華，劉昌俊，葡萄糖酸合成方法研究進展[J].化學丁業與工程，2007，24（2）：173-177.

[4] SINGH OV， RAJ KUMAR. Biotechnological production of glu-conic acid： future implications[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007（75）：713-722.

[5]金其榮，張維民，徐勤，有機酸發酵工藝[M].北京：輕工業出版社，1989.

[6]沈萍，微生物學[M].北京：高等教育出版社，2000：231- 232.

[7]周德慶，微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，2002：217.