苜蓿葉蛋白酶解物抗氧化活性研究

王宇

摘要：以苜蓿葉蛋白粉為原料，利用堿性蛋白酶水解制備寡肽。研究了不同水解度（DH）的苜蓿葉蛋白酶解物抗氧化活性。結果表明：水解度分別為15. 42%、17. 28%、19. 35%、21. 60%、22. 32%、22. 78%的苜蓿葉蛋白寡肽溶液對二苯代苦味肼基自由基（DPPH）清除能力隨水解度的增大呈現先逐漸上升后下降的趨勢，在酶解物濃度為2 mg/mL時，水解度為21. 60%時，苜蓿寡肽對DPPH清除作用最強為85. 78%。

關鍵詞：苜蓿葉蛋白；堿性蛋白酶；水解度；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.2

文獻標識碼：A

文章編號：2095-9737（2018）08-0003-02

紫花苜蓿為豆科苜蓿屬多年生草本植物。苜蓿葉產量高，葉蛋白中粗蛋白質含量為32%～65%，且蛋白質的氨基酸種類齊全、組成合理，屬優質蛋白。但大多提取后的植物葉蛋白由于溶解度較低，很難添加在乳品、飲料、糖果等食品體系中加以利用。而且植物蛋白具有一定的抗原性，其消化率和生物效價遠不及牛奶、雞蛋等動物蛋白[1]，這些都限制了植物葉蛋白的利用。通過用酸、堿或酶法對葉蛋白改性，降低蛋白分子的相對質量，對于提高其溶解性、起泡性、乳化性等功能特性、改善其口感和營養價值都具有十分重要意義。大量研究表明，蛋白質水解物多具有較好的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑使用[2]。有試驗證明苜蓿葉蛋白具有很好的生理保健功能[3]，如選擇適當的蛋白酶體外水解苜蓿葉蛋白，就有可能釋放出有活性的肽段，制備出具有特定生理功能的活性肽。因此選用來源豐富的苜蓿葉蛋白為原料研究開發葉蛋白酶解物具有重大意義。本研究采用堿性蛋白酶對苜蓿葉蛋白進行不同條件的水解，得到不同水解度的苜蓿葉蛋白酶解物，測定其抗氧化活性，為進一步開發和利用苜蓿葉蛋白提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

苜蓿葉蛋白（蛋白質含量78. 23%）堿提酸沉法制備；堿性蛋白酶（ Protamex）上海源葉生物科技有限公司，酶活力10萬u/g；二苯代苦味肼基自由基（DPPH -） Sigma公司，無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，天津市凱通化學試劑有限公司，分析純。

設備包括DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型制造廠；80 1臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；PHS- 25（數顯）pH計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FD -1真空冷凍干燥機、SHZ- 82水浴恒溫振蕩器，金壇市億能試驗儀器廠；722N可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿性蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽工藝

將一定濃度的苜蓿葉蛋白溶液，置于溫度為50℃水浴中預熱處理30 min。處理后調節至堿性蛋白酶適宜的反應溫度和pH值。隨著水解反應的進行，酶解液的pH值逐漸下降，滴加1.0 mol/L NaOH溶液保持蛋白酶最適pH值不變，記錄消耗NaOH溶液用量。100℃沸水中滅酶保持10 min。取出迅速冷卻，4000 r/min離心20 min，取上清液，冷凍干燥，計算不同酶解條件的蛋白質水解度。

本實驗進行了兩個單因素實驗：

配制底物濃度為5%的苜蓿葉蛋白溶液，將pH值分別控制在7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.O，溫度為50℃，酶添加量1000 u/g，水解3h，滅酶，離心取上清液凍干。計算其水解度。

配制底物濃度為5%的苜蓿葉蛋白溶液，將溫度分別控制在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH值為8.5，酶添加量1000 u/g，水解3h，滅酶，離心取上清液凍干。計算其水解度。

1.2.2 對二苯代苦味肼基自由基清除能力的測定

研究不同水解度的苜蓿葉蛋白酶解產物對DPPH 清除能力的影響，初步確定水解度與抗氧化活性的關系。

1.3 測定方法

1.3.1 水解度的測定采用pH-Stat法[4]。

1.3.2 蛋白質含量的測定采用微量凱氏定氮法[5]。

1.3.3 二苯代苦味肼基自由基（ DPPH-）清除能力的測定：

參考Shimadac6]的方法略作改動。各取2 mL待測樣品溶液（質量濃度為0—2.5 mg/mL），依次與2.0 mL濃度為0. 04 g/L的DPPH 無水乙醇溶液室溫避光反應30 min，在517 nm處測吸光值Ai。另取2 mL待測樣品與2 mL無水乙醇避光反應20 min，在517 nm處測吸光值Aj；以2 mLO.04 g/L DPPH 無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇反應作為參比，其吸光值為A0。可以按照下列公式計算待測樣品對DPPH 的抑制率。

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽

在兩個單因素實驗中，本論文選擇了水解度有一定差異的6個苜蓿葉蛋白酶解物。其酶解條件及水解度結果見表1。

2.2 不同水解度酶解產物的抗氧化活性的研究

堿性蛋白酶作用于苜蓿葉蛋白不同時間而得到的酶解產物的肽鏈結構和長度不同，其活性可能不同。通常期望得到的是具有特定功能的分子量較小的寡肽，若單純追求高水解度指標，雖然產生較多的游離氨基酸，但疏水性氨基酸含量可能不多，其活性不一定高，因此本論文研究不同酶解物的抗氧化活性，以探討水解度與抗氧化活性之間的關系。

大多數自由基反應活性較強而壽命短暫，DPPH 即使在室溫條件下也能保持穩定，用DPPH 清除能力反映被測物的抗氧化活性操作簡便、快速、靈敏。因此本研究考察了不同DH的苜蓿葉蛋白酶解產物對DPPH 清除能力的影響，其結果見圖1。

由圖1可知，不同DH的苜蓿葉蛋白解物對DPPH清除能力均隨底物濃度的增加而提高，當濃度為2.o mg/mL時，抑制率在50%—90%之間，顯示出較強的DPPH清除能力。這是因為樣品濃度越高，其中所含有的抗氧化性的氨基酸短肽就越多，從而抗氧化性就越強。DPPH清除力也隨著DH的增大而逐漸增大，當DH為21. 60%時達到最高（85.78%），然后隨著DH的升高而逐漸下降。這說明酶解產物的抗氧化性與其DH有關，水解度大小對肽段長短和游離氨基酸的相對含量是至關重要的，如水解度太小，則肽段過長，具有抗氧化性的一些氨基酸未能斷裂，抗氧化性較低；如水解度太大，雖游離氨基酸含量過高，但疏水性氨基酸含量下降而導致抗氧化性降低。所以，控制適當的水解度可以獲得較高抗氧化性活性的苜蓿葉蛋白肽。

3 結論

本研究進行了pH值和溫度兩個復合蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽的單因素實驗，最終選取水解度有一定差異的6個苜蓿葉蛋白酶解物作為研究對象。通過抗氧化活性實驗得出，不同DH的苜蓿葉蛋白解物對DPPH 清除能力均隨底物濃度的增加而提高，當濃度為2.o mg/mL時，抑制率在50%—90%之間，顯示出較強的DPPH 清除能力。DPPH 的清除力也隨著DH的增大呈現先升高后逐漸下降的趨勢。所以說明水解度和抗氧化活性有一定關系，但并非正相關，控制適當的水解度可以獲得抗氧化性活性較高的苜蓿葉蛋白肽。

參考文獻：

[1]楊春波，苜蓿葉蛋白的提取與應用研究[D].無錫：江南大學，2007.

[2] Di Bernardini R， Harnedy P，Bolton D， et aI.Antioxidant and antimicrobial peptidic hydrolysates from muscle proteln sources and by- products [Jl. Food Chemistry， 2011，124（4）：1296 - 1307.

[3]田麗萍，劉青廣，薛琳，苜蓿蛋白營養價值的初步研究[J]，飼料工業，2005，26（5）：56-59.

[4] Sako K， Imamura Y， Nishimata H，et al.Branched-chain amino acids supplements in the late evening decrease the frequency of muscle cramps with advanced hepatic cirrhoss[J]. HepatolRes，2003，26（4）：327-329.

[5]張水華，食品分析[M].北京：中國輕工業出版社，2007：159 -160

[6] Shimada K， Fujikawa K， Yahara K， Nakamura T.Antioxida tIve properties of xanthum on the antioxidation of soybean oilin cyclodextrin emulsion [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（6）：945-948.