分階段酶解法與膜處理結合制備楊梅汁工藝研究

樓樂燕，沈清，尹培，陳健初，葉興乾

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，馥莉食品研究院，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江省食品加工技術與裝備工程中心，浙江杭州310058）

楊梅（Myrica Rubra Sieb.et Zucc）為楊梅科楊梅屬常綠喬木植物，是我國亞熱帶特有的優良經濟樹種和生態樹種[1]。其果實的可食率達到90%以上，除了富含糖、有機酸和多種維生素以外，還含有花色苷和類黃酮成分[2-5]。楊梅成熟期較短，季節性較強，主要集中在6月中下旬，適逢高溫梅雨季節，且果實為柱狀突起，汁水豐富，采后呼吸旺盛，在貯藏和運輸中易受傷害，保鮮期非常短。因此，將楊梅加工成楊梅制品成為一種緩解銷售壓力、增加楊梅利用率的重要手段。目前楊梅的相關產品有果脯[6]、果酒[7]、果醋[8]、楊梅汁[9-10]等。其中楊梅汁作為一種果蔬汁，不僅色澤艷麗、酸甜可口，而且能保留花色苷、抗壞血酸等活性物質，具有一定的保健功能，開發潛力巨大。

楊梅原汁中含有大量的細胞壁碎塊、纖維素、果膠、蛋白質和淀粉等物質，只用離心和過濾等簡單方法較難得到澄清的果汁[11]。在楊梅汁的加工、銷售和貯藏過程中，蛋白質和果膠都是導致楊梅汁渾濁的重要因素。目前，用于楊梅果汁澄清的方法主要有酶法澄清、膜處理法、澄清劑澄清法等[12]。用明膠-單寧、殼聚糖、硅藻土等澄清劑對楊梅汁進行澄清處理是前人研究較多的方法[13]，此種方法耗時長，且對楊梅中的營養物質破壞程度較大，可能使果汁產生異味。酶法澄清可以較好的保留營養物質，但是影響酶反應的因素較多，例如，底物濃度與酶濃度的關系、反應溫度和反應時間等。膜處理法可以得到高澄清度的果汁，但是果汁在處理前需預先達到一定的澄清度，否則過多的大分子物質容易堵住濾膜，而頻繁更換濾膜則會加長操作時間，降低澄清效率。果膠酶酶解澄清技術在藍莓[14-15]，楊梅[16]，黑莓[17]等果實中均有報道，但有關蛋白酶-果膠酶對楊梅汁的酶解工藝研究未見報道。因此，本論文楊梅清汁制備工藝結合酶法和膜處理法，先采用蛋白酶和果膠酶進行分階段酶解楊梅原汁中部分蛋白質和果膠，再通過膜處理進一步澄清果汁，并通過正交試驗探究出最佳的酶解工藝。研究結果為今后工業化生產楊梅清汁飲料提供技術參數和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺種楊梅采自浙江寧波慈溪，立即冷藏至-18℃冰箱。

中性蛋白酶（20萬 U/g）、纖維素酶（5萬 U/g）、α-淀粉酶（1萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；果膠酶（3萬U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸標準品：美國Sigma公司；福林酚試劑、無水乙酸鈉（分析純）、氯化鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-10數顯恒溫攪拌水浴鍋：金壇市科杰儀器廠；UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；1510全波長酶標儀：美國Thermo Fisher公司；Color Flex EZ全自動色差計：美國Hunt Lab顏色管理公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅汁制備工藝

楊梅解凍→打漿→4層紗布粗濾→蛋白酶酶解、滅酶、離心過濾→果膠酶、纖維素酶、α淀粉酶酶解，滅酶，離心過濾→膜處理→澄清果汁

1.3.2 酶解單因素試驗

對蛋白酶的添加量、蛋白酶酶解溫度、果膠酶添加量、果膠酶酶解溫度進行探究。確定纖維素酶添加量為0.3 g/L，α-淀粉酶添加量為0.2 g/L，在本試驗中不做探究。

1.3.2.1 探究蛋白酶用量對果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶，其用量分別為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時間2 h后。果膠酶添加量0.15 g，果膠酶解階段溫度45℃，酶解時間2 h。

1.3.2.2 探究蛋白酶酶解溫度對果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，分別控制蛋白酶酶解階段溫度 45、50、55、60、65 ℃，酶解時間2 h。果膠酶添加量0.15 g，果膠酶酶解階段溫度45℃，酶解時間2 h。

1.3.2.3 探究果膠酶用量對果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時間2 h。添加果膠酶，用量分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g，果膠酶解階段溫度為45℃，酶解時間2 h。

1.2.3.4 探究果膠酶酶解溫度對果汁澄清效果的影響

取5份200mL的楊梅汁，添加蛋白酶0.03 g，蛋白酶酶解階段溫度60℃，酶解時間2 h。果膠酶添加量0.15 g，分別控制果膠酶酶解階段溫度 40、45、50、55、60℃，酶解時間2 h。

1.3.3 酶解正交試驗

根據單因素試驗結果設計四因素三水平正交試驗，進一步優化楊梅汁加工過程中分階段酶解的工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 楊梅汁酶解工藝正交試驗因素水平Table1 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

1.3.4 膜處理

將在正交試驗優化所得的最優酶解條件下處理的楊梅汁進行膜過濾，得到澄清度更高的楊梅汁。

1.3.5 主要指標測定方法

1.3.5.1 透光率的測定

以蒸餾水為參比溶液，在720 nm處測定楊梅汁的透光率。

1.3.5.2 花色苷的測定

花色苷的測定采用賈娜等[18]的pH示差方法并稍作修改。取兩個10mL容量瓶各加入1mL的楊梅汁，分別用pH1.0的緩沖液（0.2mol/LKCl∶0.2mol/LHCl=25∶67（體積比）和pH4.5緩沖液（1mol/LNaAc∶1mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90（體積比）定容，在冰箱中避光靜置2 h。分別在520 nm和700 nm下測吸光值A，花色苷含量按下式計算，結果以矢車菊3-葡萄糖苷計。

式中：A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；MW為矢車菊3-葡萄糖苷的相對分子量449.2；DF為稀釋倍數10；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾消光系數26 900；1為比色皿的光程。

1.3.5.3 色差的測定

全自動色差儀直接測定。

1.3.5.4 總酚的測定

總酚的測定采用福林酚法[19]，并稍作修改。取0.1mL樣品，加1mL福林酚試劑，混合均勻后暗處放置5min，加5mL 5%碳酸鈉溶液，加蒸餾水至25mL，混合均勻后室溫放置1 h，760 nm下測吸光值。

1.3.5.5 可溶性固形物的測定

手持式糖度計進行測定。

1.3.5.6 蛋白含量測定

使用碧云天Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行測定。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶添加量對楊梅汁澄清效果的影響

分析蛋白酶添加量對楊梅汁澄清效果的影響，結果見圖1。

圖1 蛋白酶添加量對果汁透光率的影響Fig.1 Changesof juice transm ittancew ith addition of protease

由圖1可知，蛋白酶添加量對楊梅汁透光率的影響較大，當蛋白酶添加量為0.05 g/L時，果汁透光率僅為73.23%；當添加量增加至0.1 g/L時，透光率升至87.17%，與0.05 g/L相比，差異顯著。當蛋白酶添加量繼續增加時，透光率反而降低，這有可能是因為能被反應的底物已經完全被分解，再持續增加酶用量，不但不會使酶促反應速率增加反而會限制酶促反應的速率，使得酶解效果不明顯。且蛋白酶添加量0.15、0.2、0.25 g/L 3種酶濃度對果汁的澄清效果無顯著差異。綜合考慮選取蛋白酶添加量三水平分別為0.1、0.15、0.2 g/L。

2.2 蛋白酶解溫度對楊梅汁澄清效果的影響

溫度對酶促反應速率影響較大，當溫度未達到反應最適溫度時，溫度升高，酶促反應的速率加快；當溫度超過反應的最適溫度時，酶促反應速率逐漸下降；當溫度升高到一定值時，酶逐漸變性失活蛋白酶酶解溫度對楊梅汁透光率的影響見圖2。

圖2 蛋白酶酶解溫度對楊梅汁透光率的影響Fig.2 Changesof juice transm ittancew ith proteasehydrolysis temperature

由圖2可知，當蛋白酶解反應溫度在45℃～60℃時，果汁的透光率逐漸升高，說明酶促反應速率加快。當溫度超過60℃時，果汁透光率降低，酶促反應速率減緩。55、60、65℃3種溫度下蛋白酶對楊梅汁澄清效果的影響無顯著性差異。

2.3 果膠酶添加量對楊梅汁澄清效果的影響

果膠酶添加量對楊梅汁透光率的影響見圖3。

圖3 果膠酶添加量對楊梅汁透光率的影響Fig.3 Changesof juice transm ittancew ith addition of pectinase

從圖3可以看出，當果膠酶添加量小于0.75 g/L時，楊梅汁的透光率與果膠酶的添加量呈正相關；當果膠酶含量為0.75 g/L時，楊梅汁透光率最高，為85.2%。當果膠酶添加量大于0.75 g/L時，隨著果膠酶用量的增加，楊梅汁的透光率呈下降趨勢。因此初步確定果膠酶添加量為0.75 g/L。

2.4 果膠酶酶解溫度對楊梅澄清效果的影響

果膠酶酶解溫度對楊梅汁透光率的影響見圖4。

圖4 果膠酶酶解溫度對楊梅汁透光率的影響Fig.4 Changesof juice transm ittancewith pectinasehydrolysis temperature

由圖4可知，當酶解溫度小于45℃時，楊梅汁的透光率隨著溫度的上升而升高；當酶解溫度大于45℃時，楊梅汁的透光率隨著溫度的上升而下降。在45℃～55℃時，下降趨勢較緩慢，說明此溫度區間內果膠酶的催化活性較高，這與孔祥佳等[16]的報道一致。當溫度達到60℃時，楊梅汁透光率僅有66.4%，說明此時果膠酶可能已經由于高溫而變性失活。因此選取果膠酶酶解的較適溫度為50℃。

2.5 正交試驗結果與分析

為了進一步選擇最優的酶解工藝條件，根據單因素試驗結果，選取蛋白酶用量（A）、蛋白酶解溫度（B）、果膠酶用量（A）、果膠酶解溫度（D）四因素，進行四因素三水平L9（34）正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果及極差分析見表2。

表2 楊梅汁酶解工藝正交試驗結果及極差分析Table2 Resultsand rangeanalysisof orthogonalexperimental

續表2 楊梅汁酶解工藝正交試驗結果及極差分析Continue table2 Resu ltsand rangeanalysisof orthogonal experimental

由表2可知，楊梅清汁制備過程中酶解階段各試驗因素的主次影響為D＞C＞B＞A，即果膠酶用量＞果膠酶酶解溫度＞蛋白酶酶解溫度＞蛋白酶用量。酶解階段最優工藝條件組合為A1B3C3D2，即添加0.1g/L蛋白酶，控制蛋白酶酶解階段溫度65℃，果膠酶添加量為1g/L，果膠酶酶解階段溫度50℃。在此最優工藝條件組合下進行楊梅清汁透光率的重復試驗，測得楊梅汁透光率為（89.63±0.51）%。

2.6 楊梅汁澄清前后各項指標分析

各階段處理前后楊梅汁各項成分比較見表3，不同處理后的楊梅汁實物圖見圖5。

表3 各階段處理前后楊梅汁各項成分比較Table3 Comparison of the com ponentsof bayberry juicebefore and after treatments

由表3和圖5可以看出，用蛋白酶—果膠酶澄清楊梅汁，其澄清度有了明顯的提高，此時可以較快速的通過0.2μm的醋酸纖維膜，大大縮短膜處理的時間，制備得到的楊梅清汁透光率可達95%以上。酶解處理后，楊梅汁的L*，a*，b*值都有所提高，其中L*值表示亮度，a*值為正表示紅色，為負表示綠色，b*值為正表示黃色，為負表示藍色。說明果汁變得更加透亮，色澤更加亮麗。但是花色苷的含量損失較多，酶解后僅為原汁的55.54%，再經過膜處理后又有略微的減少。可能是由于兩個階段的酶解溫度較高，花色苷在高溫下極不穩定從而降解造成的[20]。經過蛋白酶酶解后，部分蛋白質被酶解，但還有將近一半的蛋白質還存留在果汁中，再經過膜過濾，除去了幾乎所有的蛋白質，可以有效避免后續貯藏過程中蛋白-多酚類沉淀的產生。此外，本工藝條件制備下，果汁的糖度和酸度變化較小，基本保持不變。

圖5 不同處理后的楊梅汁實物圖Fig.5 The pictureof bayberry juicewith different treatments

3 結論

采用蛋白酶-果膠酶分階段處理和膜過濾相結合澄清楊梅汁，可在較短的時間內得到透光率高達95.27%的楊梅清汁。在單因素的基礎上，通過L9（34）正交試驗對酶解工藝中蛋白酶用量、蛋白酶酶解溫度、果膠酶用量、果膠酶酶解溫度進行優化，得到酶解階段的最優工藝參數：蛋白酶用量0.1 g/L，蛋白酶酶解溫度65℃，果膠酶用量1 g/L，果膠酶酶解溫度50℃，在此最優條件下制備的楊梅汁透光率可達89.63%，與楊梅粗汁相比，極顯著的提高了果汁的澄清度。

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