文蛤SRBI基因克隆及其在不同殼色群體中的差異表達

崔寶月 董迎輝 趙家熙 胡凌威 李曉英 姚韓韓 林志華

(1. 上海海洋大學水產與生命學院， 上海 201306； 2. 浙江萬里學院， 浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室， 寧波315100； 3. 淮海工學院， 江蘇省海洋生物技術重點實驗室， 連云港 222000)

SRB I (Scavenger receptor class B type I ， B類I型清道夫受體)是B型清道夫受體中的成員之一，作為類胡蘿卜素吸收過程的關鍵基因[1]， 主要是通過介導高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)影響膽固醇酯的選擇性吸收進而影響類胡蘿卜素在體內的吸收和轉運[2]。迄今為止SRBI基因已在家蠶(Bombyx mori)[3]、小鼠(Mus musculus)[4]、倉鼠(Mesocricetus auratus)[5]等模式動物中進行了大量的研究。在海洋貝類中， 僅開展過少量相關研究， 如Liu等[6]通過轉錄組比對分析， 發現SRB-Like-3基因在華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)橙色個體中表達量高； 雷超等[7]分析了馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)的B型清道夫受體的基因序列特征， 熒光定量分析發現在鰓、中央膜、閉殼肌、肝胰臟均有表達， 其中肝胰臟中表達量最高。但在文蛤中尚未見到關于SRBI的相關報道。

文蛤(Meretrix meretrix)是我國重要的經濟貝類之一， 其殼色變異豐富并且可以遺傳給后代。已有研究表明， 紅殼文蛤外套膜內比其他殼色文蛤含有更為豐富的類胡蘿卜素， 并推測類胡蘿卜素與殼色形成密切相關[8，9]。目前， 已有多位學者開展了文蛤組蛋白去乙酰化酶1[10]、生長因子受體結合蛋白2[11]、C型凝集素[12]等生長和免疫相關基因的克隆和表達特征分析， 而與文蛤殼色相關的基因尚未見報道。本研究獲得紅殼文蛤SRBI(Mm-SRBI)基因的cDNA全長以及多段內含子序列， 并分析了它在不同組織和不同殼色群體中的表達差異， 為后續深入研究文蛤殼色形成機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗文蛤材料均取自寧波市鄞州區丹艷養殖基地。隨機選擇4種殼色(暗紋、白殼、紅殼和黑斑)文蛤活體成貝各8枚， 并解剖獲得外套膜邊緣組織， 液氮速凍， –80℃保存， 樣品供以后實驗所用。隨機選擇紅殼文蛤10枚， 迅速獲取6個組織(斧足、外套膜、水管、鰓、內臟團和閉殼肌)樣品， 液氮迅速冷凍， –80℃保存待用。

1.2 實驗方法

Mm-SRBI基因cDNA全長克隆用Trizol法提取紅殼文蛤外套膜組織的總RNA， 然后用試劑盒(Clontech)合成Mm-SRBI基因cDNA。根據文蛤轉錄組文庫中SRBI基因的EST序列， 分別設計3′和5′端特異性引物SRBIF和SRBIR (表 1)， 用SMART RACE試劑盒(Clontech)擴增Mm-SRBI基因的cDNA全長。PCR產物經電泳檢測、割膠回收， 回收產物與T1(Trans)載體連接， 然后轉化至大腸桿菌中培養過夜， 挑取白斑搖菌檢測， 將陽性結果進行測序。測序結果進行比對和拼接， 得到Mm-SRBI基因的cDNA全長。

為了確保Mm-SRBI基因cDNA全長的準確性，將已經獲得的基因的cDNA全長作為模板， 分別設計SRBIF1和SRBIR1為引物(表 1)， 進行擴增和測序， 后續實驗同上。

Mm-SRBI基因的序列及進化分析利用BLAST軟件將5′-RACE片段和3′-RACE片段序列拼接， 獲得Mm-SRBI基因cDNA全長； 使用DNAMAN6.0軟件預測其氨基酸序列， 并推測其理化性質； 用ORF Finder搜索Mm-SRBI基因的開放性閱讀框；Clustal X進行氨基酸多序列比對； 利用ExPASy軟件推測該蛋白理化特性； Smart軟件進行蛋白質功能域預測； 利用TMHMM和SignalP分別進行蛋白質跨膜區和信號肽區域分析； 使用軟件Swiss Model進行蛋白質高級結構預測； 用Motif Scan搜索工具對SRBI序列進行功能位點檢測； MEGA 6.0軟件NJ法構建系統進化樹。

表 1 本實驗所用引物及其序列Tab. 1 Primers and their sequences of the experiments

Mm-SRBI基因在不同殼色和不同組織群體中的表達差異分析取上述4種殼色的外套膜和紅殼文蛤的6個組織， 提取RNA之后按照反轉錄試劑盒(TAKARA)合成cDNA， 并作為熒光定量PCR(qRT-PCR)的模板， 用PRIMER設計引物qRT-F和qRT-R (表 1)， 以18SrRNA基因(表 1)為內參， 用ABI 7500fast進行熒光定量PCR。數據處理采用相對值2–ΔΔCt進行計算， 用軟件SPSS 17.0進行統計數據得到各個組織和不同殼色群體的差異分析結果。

基因的內含子克隆提取文蛤外套膜的基因組DNA， 根據已獲得的Mm-SRBI基因的cDNA序列設計特異性引物進行PCR擴增。PCR產物經1%的瓊脂糖電泳檢測、割膠回收和連接轉化， 選取陽性克隆送測序。

2 結果

2.1 Mm-SRBI基因的cDNA全長與序列分析

Mm-SRBI基因的cDNA全長為1676 bp (Gen-Bank登錄號: KY434116)， 開放閱讀框(ORF) 1515 bp，編碼504個氨基酸， 5′-UTR長50 bp， 3′-UTR為112 bp，包含1個終止密碼子TGA和25 bp的polyA尾。

2.2 Mm-SRBI基因編碼的蛋白結構預測

SignalP軟件預測顯示， 該蛋白質沒有明顯的信號肽； ExPASy Protscale軟件預測發現， 該蛋白極性氨基酸所占的比例較高， 表現親水性； ExPASy Compute推導出Mm-SRBI蛋白的理論等電點pI=6.27， 分子量為56.87 kD。TMHMM軟件預測在結構域兩端有2個跨膜蛋白。功能域預測結果表明，Mm-SRBI蛋白含有1個CD36功能域， 其含有455個氨基酸(14—469 aa)。Swiss model軟件預測顯示，Mm-SRBI蛋白的二級結構由271個H鍵、18個螺旋和43個轉角組成。

2.3 Mm-SRBI基因與其他物種的同源性比對及進化分析

利用MEGA6.0軟件的NJ法構建系統進化樹，文蛤和其他10個物種SRBI進行了氨基酸序列比對。結果發現， 文蛤與華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis，AJM13628.1)的同源性最高為55%， 與太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas， XP_011432626.2)、海蝸牛 (Aplysia californica， XP_005103573.2)、囊舌蟲(Saccoglossus kowalevskii， XP_006815324.1)、日本對蝦 (Marsupenaeus japonicas， AKO62849.1)、羅非魚(Oreochromis niloticus， XP_003444373.1)、褐家鼠 (Rattus norvegicus， NP_113729.1)、人 (Homo sapiens， NP_005496.4)、牛(Bos taurus， NP_777022.1)、野豬(Sus scrofa， NP_999132.1)等物種的同源性為34%—51%。從構建的系統進化樹中可以看出(圖 1)，文蛤與同為無脊椎動物的瓣鰓綱、腹足綱親緣關系較近， 與哺乳綱、魚綱和甲殼綱的親緣關系較遠。

圖 1 采用MEGA6.0軟件NJ法構建的進化樹Fig. 1 The NJ phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software

2.4 不同組織和不同殼色群體表達差異分析

qRT-PCR檢測結果表明，Mm-SRBI在6個組織中(閉殼肌、外套膜、足、鰓、內臟團和水管)均有表達， 其中外套膜表達量最高， 與其他各組織間存在極顯著差異(P＜0.01)(圖 2)。Mm-SRBI基因在不同殼色文蛤的外套膜中也均有不同程度的表達， 在殼色較深的黑斑文蛤、紅殼文蛤中表達量較高， 而在白殼文蛤中表達量最低， 且它們之間有顯著性的差異(P＜0.05)(圖 3)。

2.5 Mm-SRBI基因內含子序列分析

Mm-SRBI基因共有13個外顯子和12個內含子，序列總長度為9272 bp， 且外顯子和內含子的連接處遵循AT/GT原則， 即均屬于GT-AG內含子。從序列長度來看， 4號外顯子最長為201 bp， 6號外顯子最短， 為49 bp， 其余的在51—201 bp； 8號內含子最長，為1020 bp， 6號內含子最短， 為119 bp， 其余內含子長度在396—1001 bp (圖 4)。

圖 2 Mm-SRBI基因在紅殼文蛤不同組織中的表達差異分析(n=3)Fig. 2 The expression of Mm-SRBI gene in different tissues of red shell of M. meretrix (n=3)

圖 3 Mm-SRBI基因在不同殼色文蛤外套膜中的表達差異分析(n=3)Fig. 3 The expression of Mm-SRBI gene in shells colors of M.meretrix (n=3)

圖 4 Mm-SRBI基因結構圖Fig. 4 The structure of Mm-SRBI gene

3 討論

B類Ⅰ型清道夫是膜受體蛋白， 能高親和力地結合HDL[13，14]、ox-LDL(氧化修飾低密度脂蛋白)和ac-LDL[5，15](乙酰化低密度脂蛋白)等， 還參與炎癥反應、清除凋亡細胞和宿主防御等生理反應[16—21]。目前關于SRBI基因的研究主要集中在哺乳動物和模式動物， 如在果蠅(Drosophila melanogaster)中研究了SRBI基因在類胡蘿卜素轉運中的生理功能[22，23]、在家蠶中研究了黃繭的形成[19]。本實驗首次獲得文蛤Mm-SRBI基因的cDNA全長序列1676 bp， 開放閱讀框1515 bp， 編碼504個氨基酸，這與馬氏珠母貝SRB基因的開放閱讀框有1443 bp、編碼480個氨基酸的結果大致相當[7]。Mm-SRBI蛋白含一個CD36結構域， 編碼455個氨基酸(14—469)。Mm-SRBI的CD36結構域包含C端和N端的兩個跨膜區(1—29AA和449—504AA)， 一個胞外區， 有多個糖基化、蛋白激酶磷酸化等多種位點， 這與已報道的家蠶[3]和馬氏珠母貝[7]B型清道夫受體大致相同， 因此說明Mm-SRBI屬于含有CD36結構域的B類清道夫受體家族。

已有研究證明， 類胡蘿卜素是維生素A的前體，動物不能從頭合成只能從食物中獲取[24]。SRBI基因是通過識別與高密度脂蛋白和低密度脂蛋白結合的類胡蘿卜素， 并將其轉運到細胞[18，19]。已有研究發現，SRBI基因在貝類中參與殼色的形成[8]， 如在華貴櫛孔扇貝中發現橘色貝的類胡蘿卜素含量高于白色貝， 且與B類清道夫受體基因的高表達相關，通過RNA干擾對該基因下調， 發現血液中類胡蘿卜素含量顯著降低， 為B類清道夫受體基因與類胡蘿卜素累積有關提供證據[6]。本實驗通過qRT-PCR技術證明紅殼文蛤Mm-SRBI基因在各個組織均有表達， 其中在外套膜的表達量最高； 不同殼色群體之間Mm-SRBI基因的表達量存在著較大的差異， 白殼的表達量較低而紅殼卻表達量顯著。先前的研究證明， 在紅殼文蛤外套膜中富含豐富的類胡蘿卜素，其含量是白殼文蛤的3倍多[8]。據此推測Mm-SRBI基因參與文蛤類胡蘿卜素的轉運和在外套膜上的富集， 從而影響紅殼色的形成。

大部分真核生物的基因都是由若干個編碼區和非編碼區組成的斷裂基因， 編碼區序列為外顯子，斷裂基因中的非編碼區序列為內含子。諸多研究發現， 在生物體有極少數內含子參與了機體內基因表達調節， 如果蠅組織中的長內含子在其兩側外顯子， 拼接之前通過共轉錄參與機體的表達調控[20]；小鼠血小板生成素基因(TPO)的第5內含子， 可以提高TPO的表達[25]； 文蛤長鏈脂肪酸-CoA連接酶(ACSL)內含子中， 有5個SNP與生長性狀顯著相關[26]。本研究克隆得到Mm-SRBI基因7596 bp的內含子序列， 分析表明內含子核苷酸序列均符合“GT開頭，AG結尾”的原則， 是真核生物RNA剪切的識別位

參考文獻:

[1] Jin Q， Bi Y L， Liu X M，et al. Recent advances on research of carotenoid metabolism and functions [J].Chinese Journal of Animal Nutrition， 2014， 26(12):3561—3571 [靳青， 畢宇霖， 劉曉牧， 等. 類胡蘿卜素代謝及功能研究進展. 動物營養學報， 2014， 26(12):3561—3571]

[2] Tsuchida K， Sakudoh T. Recent progress in molecular genetic studies on the carotenoid transport system using cocoon-color mutants of the silkworm [J].Archives of Biochemistry & Biophysics， 2015， 572: 151—157

[3] Dong Z P， Chai C L， Dai F Y，et al. Identification， phylogentic and expressional analyses of class B scanvenger receptor genes in silkworm，Bombyx mori[J].Science of Sericulture， 2010， 36(5): 743—753 [董占鵬， 柴春利， 代方銀， 等. 家蠶B型清道夫受體基因的鑒定及系統發生與表達分析. 蠶業科學， 2010， 36(5): 743—753]

[4] Akita N， Tsujita M， Yokota T，et al. High density lipoprotein turnover is dependent on peroxisome proliferator-activated receptor α in mice [J].Journal of Atherosclerosis &Thrombosis， 2010， 17(11): 1149—1159

[5] Acton S L， Scherer P E， Lodish H F，et al. Expression cloning of SR-BI， a CD36-related class B scavenger receptor [J].Journal of Biological Chemistry， 1994，269(33): 21003—21009

[6] Liu H， Zheng H， Zhang H，et al. A de novo transcriptome of the noble scallop，Chlamys nobilis， focusing on mining transcripts for carotenoid-based coloration [J].BMC Genomics， 2015， 16(1): 2—13

[7] Lei C， Bei W L， Zheng Z，et al. Molecular characterization and expression analysis ofPmSR-Bgene from pearl oysterPinctada fucata martensii[J].Journal of Guangdong Ocean University， 2017， 37(1): 7—14 [雷超， 貝偉烈， 鄭哲， 等. 馬氏珠母貝B型清道夫受體PmSR-B基因克隆與表達性分析. 廣東海洋大學學報， 2017， 37(1):7—14]

[8] Qi X Y. The analysis of molecular mechanisms of shell color formation forMeretrix meretrix[D]. Ningbo University. 2014 [齊曉艷. 文蛤(Meretrix meretrix)殼色花紋性狀的分子遺傳基礎研究. 寧波大學. 2014]

[9] Zhan Y L. Identification of shell color and the related gene and microRNA research ofMeretrix meretrix[D].Zhejiang Wanli University. 2015 [詹艷玲. 文蛤(Mere-點。文蛤與其他物種報道的SRBI基因的內含子數量略有不同， 如家蠶SRBI基因有10個外顯子和9個內含子[27]， 人的SRB1由13個外顯子和12個內含子組成等[21，28]。而在文蛤Mm-SRBI基因中擴增得到12個內含子， 均存在于開放閱讀框， 與其他物種相差不大。至于Mm-SRBI基因的內含子是否對殼色形成有影響， 還需要進一步研究。trix meretrix)殼色的鑒定及其相關基因和microRNA研究. 浙江萬里學院. 2015]

[10] Gao X Y， Dong Y H， Yao H H，et al. Cloning， spatiotemporal expression and SNPs identification ofHDAC1 gene in hard clamMeretrix Meretrix[J].Acta Hydrobiologica Sinica， 2016， 40(3): 601—608 [高曉艷， 董迎輝， 姚韓韓，等. 文蛤HDAC1基因克隆、時空表達及生長相關SNP位點篩查. 水生生物學報， 2016， 40(3): 601—608]

[11] Gao X Y， Dong Y H， Shi S J，et al. Cloning， spatiotemporal expression and SNPs identification ofGRB2 gene in hard clamMeretrix meretrix[J].Journal of Fisheries of China， 2015， 39(9): 1324—1332 [高曉艷， 董迎輝， 施沈佳， 等. 文蛤生長因子受體結合蛋白2(GRB2)基因克隆、時空表達及SNP位點篩查. 水產學報， 2015， 39(9):1324—1332]

[12] Li M， Zhou S M， Liu L，et al. Molecular clone and expression of C-TYPE lectin inmeretrix meretrix[J].Oceanologia et Limnologia Sinica， 2015， 46(5): 1186—1192 [李猛， 周素明， 劉璐， 等. 文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表達分析. 海洋與湖沼，2015， 46(5): 1186—1192]

[13] Acton S， Rigotti A， Landschulz K T，et al. Identification of scavenger receptor SR-BI as a high density lipoprotein receptor [J].Science， 1996， 271(5248): 518—520

[14] Trigatti B L， Fuller M. HDL signaling and protection against coronary artery atherosclerosis in mice [J].The Journal of Biomedical Research， 2016， 30(2): 94—100

[15] Seizer P， Schiemann S， Merz T，et al. CD36 and macrophage scavenger receptor a modulate foam cell formationviainhibitio19n of lipid-laden platelet phagocytosis [J].Semin Thromb Hemost， 2010， 36(2): 157—162

[16] Cai L， Ji AL， de Beer FC，et al. SR-BI protects against endotoxemia in mice through its roles in glucocorticoid production and hepatic clearance [J].Journal of Clinical Investigation， 2008， 118(1): 364—375

[17] Mouss M， Landrier J F， Reboul E，et al. Lycopene absorption in human intestinal cells and inmice involves scavenger receptor class B type I but not Niemann-Pick C1-like 1 [J].The Journal of Nutrition， 2008， 138(8):1432—1436

[18] Georg Lietz， Anthony Oxley， Christine Boesch-Saadatmandi，et al. Importance of β，β-carotene 15，15′-monooxygenase 1 (BCMO1) and β，β-carotene 9′，10′-dioxygenase 2(BCDO2) in nutrition and health [J].Molecular Nutrition &Food Research， 2012， 56(2): 241—250

[19] Kiefer C， Sumser E， Wernet M F，et al. A class B scavenger receptor mediates the cellular uptake of carotenoids in Drosophila [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002， 99(16): 10581—10586

[20] Georgomanolis T， Sofiadis K， Papantonis A. Cutting a long intron short: recursive splicing and its implications[J].Frontiers in Physiology， 2016， 7: 1—5

[21]Niemsiri V， Wang X， Pirim D，et al. Genetic contribution ofSCARB1variants to lipid traits in African Blacks: a candidate gene association study [J].BMC Medical Genetics， 2015， 16(1): 1—30

[22] Voolstra O， Kiefer C， Martin Hoehne，et al. The Drosophila class B scavenger receptor NinaD-I is a cell surface receptor mediating carotenoid transport for visual chromophore synthesis [J].Biochemistry， 2006， 45:13429—13437

[23] Dong ZP， Chai C L， Dai F Y，et al. Expression pattern and tissue localization of the class B scavenger receptor BmSCRBQ4 inBombyx moil[J].Insect Science， 2015，22(6): 739—747

[24] Kaestner K H， Ntambi J M， Kelly，T J Jr，et al. Differentiation-induced gene expression in 3T3-L1 preadipocytes. A second differentially expressed gene encoding stearoyl-CoA desaturase [J].The Journal of Biological Chemistry，1989， 264(25): 14755—14761

[25] Li Y， Zhou M， Zhou H，et al. The last intron of the human thrombopoietin gene enhances expression in milk of transgenic mice [J].Functional & Integrative Genomics，2014， 14(1): 229—236

[26] Dai P， Huan P， Wang H，et al. Characterization of a longchain fatty acid-CoA ligase 1 gene and association between its SNPs and growth traits in the clamMeretrix meretrix[J].Gene， 2015， 566(2): 194—200

[27] Dong Z P， Chai C L， Dai F Y，et al. Cloning， Expression Feature， and Tissue Location of BmSCRBQ1， a Class B Scavenger Receptor inBombyx mori(L.) [J].Annals of The Entomological Society of America， 2013， 106(4):503—509

[28] Cao G， Garcia C K， Wyne K L，et al. Structure and localization of the human gene encoding SR-BI/CLA-1. Evidence for transcriptional control by steroidogenic factor 1[J].Journal of Biological Chemistry， 1997， 272(52):33068—33076