不同脂肪源對細鱗鮭生長、脂質代謝及抗氧化性能的影響

劉 洋 高 堅 曹小娟 尹家勝 劉紅柏

(1. 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所， 哈爾濱 150070； 2. 華中農業大學水產學院， 武漢 430070)

脂肪是水產動物維持其生命活動必需的營養物質。飼料脂肪是水產動物重要的能量和必需脂肪酸的來源， 也是脂溶性維生素的媒介體[1，2]。魚油富含n-3系列高不飽和脂肪酸(n-3 HUFA)， 一直是水產飼料的主要脂肪源。近年來， 由于水產養殖業的迅猛發展和高脂飼料的廣泛應用， 致使魚油的需求量持續增大， 價格不斷攀升， 嚴重的影響了水產養殖業的健康可持續發展。因此， 尋找合適的替代脂肪源是水產飼料行業急需解決的產業問題[3]。植物油產量巨大、來源穩定且價格相對低廉， 是魚油最可能的替代品之一。很多研究也證明了大豆油、菜籽油和棕櫚油等植物油在水產飼料中具有較好的效果[4—6]。然而包括植物油在內的絕大多數的潛在替代脂肪源雖可有效的提供能量， 滿足魚類的生長需求， 卻因缺乏n-3 HUFA而不具有理想的必需脂肪酸組成， 因而會顯著影響魚類的健康狀態、魚體脂肪酸組成和營養價值[2]。有研究顯示，以葵花籽油為脂肪源的飼料投喂大西洋鮭(Salmo scalar)會導致其心血管功能紊亂及應激狀態下死亡率增高[7]。不同的棕櫚油替代水平對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的生長和飼料效率均沒有明顯影響， 但顯著影響了魚體脂類的代謝、降低了魚肉中n-3 HUFA的含量[8]。因此， 魚油的適宜替代水平、替代時間及如何最大程度降低替代品對魚肉品質的負面影響應是魚油替代技術關注的重點。

鮭鱒魚類是世界上僅次于鯉科魚類、羅非魚的第三大養殖類群， 也是國際高端水產貿易品種和歐美發達國家主要的消費種類[9]。鮭鱒魚類屬典型的冷水性魚類， 一般對脂類有較高的需求和利用能力， 且可以將C18 PUFA轉化成HUFA， 是研究魚油替代技術的理想種類。但不同種類對脂肪的利用方式和能力也存在較大差別， 如虹鱒在21%的脂肪水平下獲得較好的生長[10]， 褐鱒(Salmo trutto)在脂肪含量29%時獲得更好的生長[11]， 大西洋鮭則可以利用高達40%左右的脂肪水平[12]。對必需脂肪酸(EFA)而言， 虹鱒為18: 3n-3和n-3 HUFA， 而18: 2n-6和18: 3n-3對大麻哈魚(Oncorhynchus kisutch)都具有必需脂肪酸的效果[13—15]。

細鱗鮭(Brachymystax lenok)隸屬于鮭科細鱗鮭屬， 是我國珍稀名貴的土著冷水性魚類[16]。目前，細鱗鮭的全人工繁育技術已獲成功， 黑龍江、遼寧、山東、山西等多省和地區開展了規模化的人工養殖， 取得了較為可觀的經濟和社會效益[17]。然而細鱗鮭營養與飼料的研究仍十分有限， 關于細鱗鮭的脂肪需求雖已有少量研究[18]， 但未見不同脂肪源對細鱗鮭生長和生理機能影響的報道。本文通過研究不同脂肪源對細鱗鮭生長、脂代謝及抗氧化性能的影響， 旨在評價細鱗鮭對不同脂肪源的利用效果和差異， 篩選出適宜的替代脂肪源， 優化飼料配方和投喂策略。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗基礎飼料以脫脂魚粉和豆粕為主要蛋白源， 玉米淀粉和糊化淀粉為糖源。在基礎飼料中添加魚油(FO)、菜籽油(CO)、棕櫚油(PaO)及大豆油(SO)， 共配制4種實驗飼料(蛋白和脂肪水平分別為47%和12%)[18，19]。其中， 魚油購自日本Riken Vitamin公司， 棕櫚油購自上海益海嘉里食品營銷有限公司， 菜籽油和大豆油則是通過壓榨自制獲得。每組飼料中均加0.02%的2， 6-二叔丁基對甲酚(BHT)作為抗氧化劑。所用固體原料混合前先粉碎， 過60目篩， 微量成分采取逐級擴大法添加。精確稱量不同的油脂， 加入到預混好的所有粉狀物中， 充分混勻后擠壓制成直徑為2 mm的顆粒， 陰涼通風處干燥后， 保存在–20℃冰箱中保存待用。飼料配方和飼料脂肪酸組成分別見表 1和表 2。

1.2 飼養管理

本實驗在北京市懷柔區一渡河魚場的流水圓形培育池中進行(魚池直徑2 m)。實驗用細鱗鮭幼魚來自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所渤海冷水魚試驗站。實驗魚在流水圓形培育池中馴養4周以上， 馴養期間， 每天飽食投喂北京漢業科技有限公司生產的鮭鱒魚商品飼料(粗蛋白49.17%，粗脂肪16.26%)。實驗開始前， 挑選規格一致、健康的幼魚， 隨機分成4組， 每組3個重復， 每個重復25尾， 分別飼養于直徑為80 cm的圓形網箱中， 每個流水圓形培育池放置3個網箱。實驗期間， 每天飽食投喂2次， 水流速度控制在0.4—0.5 m/s， 溶解氧大于6 mg/L， 水溫13—17℃， 水深30 cm， 自然光周期，實驗持續52d。

1.3 樣品采集

實驗結束時， 將魚饑餓24h后， 對每個網箱中的魚進行稱重和計數， 用于計算增重率、特定生長率和成活率等指標。從每個網箱中隨機抽取4尾魚進行樣品采集(每個處理共12尾)。實驗魚經麻醉(MS222， 200 mg/L)后， 應用2.5mL一次性注射器尾靜脈采血， 室溫靜置4h后， 4000 r/min離心15min， 取上清液， 置于液氮中保存， 同時采集肝臟和肌肉保存于液氮中， 采集的樣品用于血清生化、組織粗成分分析、脂肪酸組成分析、抗氧化酶測定及基因表達分析。

表 1 實驗飼料配方及生化組成Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets

1.4 樣品分析

粗成分分析飼料和魚體的干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰分的測定參照AOAC[20]的方法進行。干物質在105℃烘箱烘至恒重， 通過失重法測定； 粗蛋白采用凱氏定氮法測定； 粗脂肪采用索氏抽提法測定； 灰分在550℃馬福爐中焚燒3h， 通過失重法測定。

脂肪酸分析脂肪酸分析參照Bligh和Dyer[21]的方法進行， 然后采用固相萃取小柱(Sep-Pak Silica Cartridges； Waters Corp. Milford， MA)分離中性和極性脂肪， 并測得其含量。實驗飼料和組織的脂肪酸組成分析采用氣相色譜(Agilent Technologies Inc.， SantaClara， California， USA； column:OmegawaxTM320)參照Teshima等[22]的方法進行。

血清生化及抗氧化酶測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)， 肝臟過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和活性氧(ROS)含量均采用南京建成生物與工程研究所試劑盒測定。詳細步驟參見試劑盒說明書。TBARS值的測定是根據Burk等[23]的方法進行的。

表 2 實驗飼料脂肪酸組成(%總脂肪酸)Tab. 2 The fatty acid composition of experimental diets (% of total fatty acids)

基因表達總RNA利用Takara公司的RNAiso Plus試劑盒(Takara Co. Ltd， Tokyo Japan)進行提取。提取的總RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 觀察電泳條帶， 將具有清晰的28S、18S和5S條帶的RNA在Nanodrop 2000進行濃度及260 nm和280 nm下吸光度A值的檢測， 并計算A260/A280的值。將此值在1.9—2.0之間， 濃度在130 ng/μL以上的RNA為模板， 利用Takara公司的PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉錄反應。在PCR儀上進行反轉錄反應， 條件為: 37℃15min， 85℃ 5s。反應結束后將逆轉錄得到的cDNA稀釋5倍， 于–20℃保存備用。

實時熒光定量PCR (qPCR)是利用特定基因引物來檢測特定基因表達水平的方法。qPCR分析使用SYBR Green I fluorescence kit試劑盒(Bio-Rad，Hercules， CA， USA)在Mini Opticon real-time detector分析檢測儀(BIO-RAD， Hercules， CA USA)上進行。反應體系總體積為20 μL， 包括: 10 μL SYBR?Green Real-time PCR Master Mix， 5 μL cDNA模板，2 μL引物(上下游引物各1 μL， 濃度為10 mmol/L)和3 μL H2O。引物見表 3。qPCR反應條件為: 95℃預變性30s； 95℃ 5s， 57℃ 30s， 72℃ 30s， 共40個循環。每個反應設3個重復。在qPCR分析之前， 對每對引物進行檢測， 保證每條基因的擴增效率均在100%左右。相對表達水平采用2–ΔΔCt方法進行計算(Livak and Schmittgen 2001)。本實驗選取β-actin作為內參基因， 其在各實驗組細鱗鮭肝臟中的表達水平均無顯著性差異。

1.5 數據分析

增重率(WG)、特定生長率(SGR)、攝食率(FR)、飼料效率(FE)及肝體指數(HSI)按下列公式計算:

表 3 實時熒光定量PCR特異性引物Tab. 3 Specific primers for PCR used in the real-time fluorescent quantitation experiments

上述公式中的Wt(g)和W0(g)分別表示實驗結束和實驗開始時魚體濕重，WL(g)表示肝臟濕重，t為實驗天數，FI(g)為干物質攝食量。

應用統計軟件Statistica 6.0進行統計分析。實驗結果經過單因素方差分析(one-way ANOVA)后進行多重比較(Duncan’s multiple range tests)， 顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果

2.1 生長與飼料利用

如表 4所示， 各實驗組的成活率均達98%以上，無顯著差異(P＞0.05)。各處理組細鱗鮭的攝食率無顯著差異(P＞0.05)， 而增重率、特定生長率和飼料效率均以魚油和大豆油組最高， 棕櫚油組次之， 菜籽油組最低， 其中大豆油組與魚油組無顯著差異(P＞0.05)， 而棕櫚油組和菜籽油組顯著低于魚油組(P＜0.05)。

2.2 肌肉粗成分分析

如表 5所示， 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分均無顯著影響(P＞0.05)。

2.3 肌肉脂肪酸組成

表 6所示為不同脂肪源飼料對細鱗鮭幼魚背肌的脂肪酸組成。結果顯示魚體肌肉脂肪酸組成明顯的反映了實驗飼料的脂肪酸組成。各組肌肉的脂肪酸都含有大量的16:0、18:1n-9、18:2n-6和22:6n-3。魚油組的總n-3系列脂肪酸、EPA和DHA含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)， 棕櫚油組的16:0和18:1n-9含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)，大豆油組18:2n-6含量顯著高于其他處理(P＜0.05)，而菜籽油組的18:3n-3含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)。

2.4 血清生化

如表 7所示， 投喂以大豆油為脂肪源的細鱗鮭幼魚血清中甘油三酯含量顯著高于其他處理組， 魚油組為最低(P＜0.05)， 魚油組總膽固醇含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)， 棕櫚油的高密度脂蛋白含量顯著低于其他處理組(P＜0.05)， 各處理組低密度脂蛋白含量沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.5 肝臟脂肪代謝相關基因表達

如圖 1所示， 細鱗鮭幼魚肝臟中ACC1、FAS和Δ6 Fad的mRNA表達水平受到飼料脂肪源的顯著影響(P＜0.05)。與魚油組相比， 各植物油組的ACC1和FAS的mRNA表達量明顯下調， 而Δ6 Fad的mRNA表達量則明顯上調(P＜0.05)， 各植物油組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。

表 4 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚生長和飼料利用的影響Tab. 4 Effects of different dietary lipid sources on the growth performance and feed utilization of juvenile Brachymystax lenok (Mean±SE)

表 5 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚肌肉粗成分分析的影響Tab. 5 Effect of different dietary lipid sources on the crude components of muscle (dry-weight basis) in juvenile Brachymystax lenok(Mean±SE)

表 6 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚肌肉脂肪酸(%總脂肪酸)組成的影響Tab. 6 Effects of different dietary lipid sources on the fatty acid compositions of muscle lipid in juvenile Brachymystax lenok (% of total fatty acids， Mean±SE)

表 7 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚血清生化指標的影響Tab. 7 Effects of different dietary lipid sources on the biochemistry composition of serum in juvenile Brachymystax lenok (mmol/L，Mean±SE)

2.6 肝臟抗氧化酶活性和TBARS值

表 8所示為投喂不同脂肪源飼料的細鱗鮭幼魚肝臟抗氧化酶含量。結果顯示， 魚油組和大豆油組的肝臟ROS含量顯著高于菜籽油組(P＜0.05)； 各處理組的SOD和CAT含量無顯著差異(P＞0.05)； 魚油組和菜籽油組的MDA含量顯著低于其他處理組(P＜0.05)； 大豆油組的GPx含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)； 魚油組的TBARS值最高， 其次為大豆油組， 菜籽油和棕櫚油組最低(P＜0.05)。

3 討論

3.1 生長與飼料利用

許多研究表明植物油可以部分甚至完全替代魚油而不影響魚類的生長[4，24]。本實驗研究結果顯示， 經過52d的投喂， 各處理組細鱗鮭的增重率達85%以上、成活率接近100%， 表明細鱗鮭幼魚對各種脂肪源即魚油、菜籽油、棕櫚油和大豆油均表現出較好的吸收和利用能力。各處理組細鱗鮭的攝食率無顯著差異， 但增重率、特定生長率和飼料效率均以魚油和大豆油組最高， 棕櫚油組次之， 菜籽油組最低， 其中大豆油組與魚油組無顯著差異(P＞0.05)， 而棕櫚油組和菜籽油組顯著低于魚油組(P＜0.05)。不同脂肪源對細鱗鮭生長影響的原因可能與細鱗鮭對不同脂肪酸的利用能力及由此導致的飼料轉化率的差異有關。鮭鱒魚類起主要作用的必需脂肪酸是n-3系列高不飽和脂肪酸， 并具有將18: 3n-3轉化為n-3 HUFA的能力[25，26]。與其他鮭鱒魚類相類似， 細鱗鮭能夠很好的利用大豆油， 投喂含有大豆油的飼料在增重率上與魚油組沒有顯著差異(P＜0.05)。而大豆油不僅富含亞油酸(18:2n-6)， 還含有豐富的n-3系列脂肪酸亞麻酸(18:3n-3)，這可能是大豆油替代魚油對細鱗鮭和其他鮭鱒魚類具有良好效果的原因。棕櫚油含有豐富的棕櫚酸、油酸和亞油酸， 能夠替代魚油而不影響虹鱒和大西洋鮭的生長[4，27]， 但在本實驗中， 投喂棕櫚油的細鱗鮭在生長性能顯著低于魚油組(P＜0.05)， 這可能是由于棕櫚油中不含亞麻酸， 亞油酸含量低于大豆油以及細鱗鮭對棕櫚油的利用能力較差造成。需要指出的是， 雖然棕櫚油組生長性能低于大豆油組， 但卻未達到顯著性水平， 提示棕櫚油仍然是細鱗鮭飼料潛在替代脂肪源的選擇之一。許多研究表明以菜籽油投喂虹鱒、大西洋鮭、大鱗大麻哈(Onlorhyncus tshawytscha)、褐鱒對生長、飼料轉化和成活都沒有產生負面的影響[28—31]。但在本實驗中投喂菜籽油的細鱗鮭在生長和飼料利用方面均不如魚油和大豆油組。這可能與本實驗中的脂肪水平、菜籽油中的亞油酸和亞麻酸含量， 以及細鱗鮭對菜籽油的利用效率有關。

圖 1 飼料脂肪水平對細鱗鮭肝臟脂肪代謝相關基因表達的影響Fig. 1 Effects of different dietary lipid sources on the mRNA expressions levels of the related genes involved in fatty acid metabolism in the liver of juvenile Brachymystax lenok

3.2 脂質代謝

在本實驗中由于養殖時間較短， 投喂魚油和植物油的細鱗鮭肌肉脂肪含量僅呈現出升高趨勢并沒有達到顯著性的水平。血清生化指標可以及時準確的反映魚體的生理狀態。與魚油相比， 植物油脂導致了細鱗鮭血清中甘油三酯含量的顯著升高以及膽固醇含量的顯著降低， 這也與淡水生活史階段大西洋鮭的研究結果相一致[32]。導致這一結果的原因可能與飼料的脂肪酸組成有關。研究表明20:5n-3具有降低甘油三酯合成和分泌的功能[33]， 這可能是攝食魚油的細鱗鮭血清甘油三酯含量較低的原因。與魚油相比， 植物油含有較高水平的植物甾醇， 而植物甾醇能夠影響膽固醇的吸收和代謝[34]，這可能是攝食植物油的細鱗鮭血清膽固醇含量降低的主要原因。

許多研究表明， 多種魚類肌肉的脂肪酸組成與飼料的脂肪酸組成緊密相關[35]。本研究中投喂植物油為脂肪源的飼料導致細鱗鮭總n-3系列脂肪酸、EPA和DHA含量顯著降低。這也與虹鱒[4]、大西洋鮭[36]和褐鱒[31]等鮭鱒魚類的研究結果相一致。攝食含18:2n-6較多的飼料(大豆油和菜籽油)肌肉中的20:4n-6含量較其他組高， 但攝食亞油酸含量更為豐富的大豆油組和菜籽油組之間卻沒有呈現出顯著差異， 說明細鱗鮭雖可以利用一定的18:2n-6， 但轉化能力有限。然而， 攝食大豆油的細鱗鮭可以明顯提升肌肉中的DHA含量， 表明細鱗鮭可以更好的利用18:3n-3， 這也應是攝食大豆油的細鱗鮭生長性能接近魚油組的主要原因。

表 8 不同脂肪源對細鱗鮭幼魚肝臟抗氧化酶活性和TBARS值的影響Tab. 8 Effects of different dietary lipid sources on the activities of anti-oxidant enzymes and TBARS value in the liver of juvenile Brachymystax lenok (Mean±SE)

肝臟是魚類脂質代謝的主要器官， 因此， 我們也研究了不同脂肪源對肝臟主要脂質代謝酶mRNA表達量的影響。乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)和脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成過程中的主要限速酶，而脂肪酸去飽和酶(Δ6 Fad)在LC-PUFA的生物合成中發揮重要作用， 18:2n-6和18:3n-3都需要Δ6 Fad的催化作用轉化為18:3n-6和18:4n-3才能完成后續的反應[37]。本研究中魚油組的ACC1和FAS表達量都顯著高于各植物油組， 而Δ6 Fad表達量顯著低于各植物油組， 也進一步證明直接攝食富含DHA的魚油更能促進細鱗鮭肌肉中n-3HUFA的積累， 而以植物油為脂肪源的細鱗鮭則需利用Δ6 Fad的去飽和作用合成HUFA。這也與其他鮭鱒魚類的研究結果相類似， 與攝食魚油相比， 攝食植物油也顯著提高了大西洋鮭和虹鱒肝臟中 Δ6 Fad活性[38，39]。

3.3 抗氧化性能

活性氧(reactive oxygen species， ROS) 是需氧細胞在代謝過程中產生的一系列活性氧簇， 包括超氧自由基(O2)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(-OH)等[40]。低濃度時， ROS可能對一些過程是有益的或甚至是必不可少的， 如對微生物的防御， 促進吞噬細胞活性。相反， 高劑量與/或ROS清除不足會導致引發嚴重新陳代謝失調并最終使動物健康狀態受損[41]。抗氧化酶是衡量機體健康與否的重要指標。抗氧化酶活力升高一方面能說明機體受到了一定的刺激； 同時另一方面也說明， 機體對外界刺激的反應能力很強， 通過提高酶的活力保護機體免受更深的損傷[42]。在本實驗中， 除菜籽油組略低外，魚油組、棕櫚油組和大豆油組細鱗鮭肝臟的ROS水平沒有顯著差異， 表明投喂植物油對細鱗鮭沒有造成明顯的氧化損傷。但與魚油組相比， 投喂植物油的細鱗鮭肝臟抗氧化酶活力多呈現升高的趨勢， SOD、CAT雖沒有顯著差異， 但大豆油組的GPx和MDA水平及棕櫚油組的MDA水平顯著高于魚油組。這一結果表明， 雖然投喂大豆油和棕櫚油還沒有造成細鱗鮭ROS水平的明顯升高及氧化損傷， 但對細鱗鮭產生了一定程度的應激， 而細鱗鮭則通過提高抗氧化酶的活力來保護機體免受氧化損傷。大豆油和棕櫚油的抗氧化酶活力最高， 且生長性能與魚油組也最接近， 表明大豆油和棕櫚油具有更好的提高魚體抗氧化水平的能力， 這可能也與它們都富含天然抗氧化劑維生素E有關。

4 結論

菜籽油和棕櫚油對細鱗鮭的生長性能產生一定的負面作用， 而魚油和大豆油對細鱗鮭幼魚的生長和魚體粗成分的影響沒有顯著差異， 可作為細鱗鮭幼魚的脂肪源。細鱗鮭具有將18:3n-3轉化為22:6n-3的能力， 但轉化18:2n-6的能力有限， 因此n-3系列脂肪酸是細鱗鮭起主要作用的必需脂肪酸。植物油會導致細鱗鮭肌肉n-3 HUFA含量顯著降低，從而影響細鱗鮭的營養價值。

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