長江江豚細菌性疾病的診治

劉志剛 鄭愛芳 陳敏敏 連玉喜 蔣胡艷 于道平

(1. 安慶師范大學生命科學學院， 安慶 246011； 2. 水生生物保護與水生態修復安徽省高等學校工程技術研究中心， 安慶 246011)

長江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis)是鼠豚科唯一的淡水種類， 生活在長江中下游及毗鄰的洞庭湖和鄱陽湖， 目前的種群數量已不足1000頭， 且每年以13.7%的速度下降[1，2]。2014年起， 農業部把長江江豚視為I級重點保護動物，2016年發布了《長江江豚拯救行動計劃2016—2025》， 其中明確提出加快建立長江江豚易地保護。

長江江豚極度瀕危， 遷地保護被認為是最重要和最有效的保護措施， 這也是未來主要推動的保護措施之一， 目前國內已建成4個遷地保護區和1個人工養殖群體， 遷地保護的種群數量接近100頭， 并且各保護區一定程度上實現了小環境下的自我繁育。但是這些區域由于水域面積有限， 水體流動不暢， 江豚活動范圍相對較小， 溫度顯著上升的季節病原微生物也容易滋生， 易引起江豚抵抗力下降和誘發疾病[3—7]。

江豚、白鱀豚等大型水生動物由于操作難度大， 發病后癥狀不明顯， 再加上專業人員缺乏， 所以目前關于豚類疾病方面的研究報道很少， 在已報道的研究中以細菌感染引起的呼吸系統疾病、消化系統疾病以及皮膚病最為常見且危害最大。20世紀70年代以來曾有相關學者[8]在人工環境下飼養過4頭白暨豚， 其中3頭都因呼吸系統和消化系統的疾病而死亡； 趙慶中等[8]在對大量死亡江豚進行剖解時發現， 人工環境下飼養初期死亡的江豚大部分死因為內科疾病； 于道平等[9]在對野外捕獲的7頭江豚進行健康調查中發現， 健康個體只占30%， 其余個體均存在不同程度的貧血癥， 且有兩頭江豚呼吸系統癥狀較明顯， 后經病原分離發現其致病菌為銅綠假單胞菌和醋酸不動桿菌； 郭政等[10]在對生活在豚館里一頭有呼吸道癥狀的江豚進行病原分離時獲得了一株致病菌銅綠假單胞菌； 張西斌[7]在對銅陵半自然水域生活的江豚進行健康體檢時發現， 大部分江豚健康狀況良好， 但個別江豚存在貧血、身上長瘤狀物以及患呼吸道疾病的風險。另外， 江豚疾病診治方面， 成功的案列非常少， 目前除郭政等使用抗生素療法對一頭感染銅綠假單胞菌的病豚治療成功以外[10]， 目前還沒有其他相關報道。

本文利用獸醫學診斷方法對安慶西江圍網內一頭感染細菌疾病的江豚進行了綜合診斷， 并將靜脈輸液技術與科學護理運用到治療過程中， 實現了對江豚的成功救治。本研究的成功開展， 對江豚、海豚等鯨類動物疾病的診斷與治療具有重要的借鑒意義， 同時也為未來長江江豚遷地保護種群的健康管理提供了科學指導。

1 材料與方法

1.1 患病江豚基本情況

患病江豚來源于安慶西江江豚救護中心， 發病前被一直飼喂于圍網環境中， 成年雄性， 營養狀況良好， 全身皮膚無明顯外傷， 眼結膜充血潮紅， 糞便稍稀， 體溫36.5℃， 治療前已拒食5d左右， 水中游泳動作稍遲緩。具體體征測量指標為: 體長154 cm，體重48 kg， 腋下圍88 cm， 最大圍94 cm。

1.2 試劑材料

大豆酪蛋白瓊脂TSA培養基、TSB培養基、Baird-Parker瓊脂平板、血平皿培養基購自青島海博生物技術有限公司； DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖、Loading Buffer等PCR擴增及鑒定相關試劑購自武漢生物技術有限公司； 革蘭氏染色液， 購自武漢谷歌生物有限公司； 藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司； 血液血常規、生化采集管購自安慶海軍醫院； 16S rRNA通用引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 病原菌的分離鑒定

細菌分離培養 用棉簽沾取滅菌生理鹽水對江豚呼吸孔及周邊皮膚進行清潔處理， 之后分別用血平皿、Baird-Parker瓊脂平板以及TSA平板無菌采集患病江豚呼吸孔微生物， 37℃恒溫培養24h，挑取單一菌落接種TSA培養基， 在相同條件下培養16—18h對菌株進行純化， 純化后挑取單一菌落， 經革蘭氏染色鏡檢， 對細菌進行形態學鑒定。

細菌PCR鑒定 利用細菌基因組提取試劑盒， 對純化后的菌液進行基因組提取， 以提取后的DNA溶液作為模板， 使用16S rRNA通用引物(27F :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG， 1492R: TACGGC TACCTTGTTACGACTT)對分離菌株進行PCR鑒定。PCR反應體系(25 μL)為: 27F和1492R引物各1 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL， dNTP 1 μL， 10×TaqDNA Buffer 2.5 μL， DNA模板5 μL， ddH2O 14 μL。PCR反應條件為: 95℃預變性5min， 94℃變性45s，54℃退火30s， 72℃延伸1.5min， 30個循環后， 72℃進一步延伸10min， 16℃ 10min。PCR產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測， 陽性樣品送上海生工生物工程技術有限公司測序。測序結果通過GenBank中Blast應用對序列進行比對， 確定分離菌屬性。

1.4 血樣檢驗

江豚尾鰭靜脈采取血液6 mL， 分別分裝于血常規采集管和生化采集管各2 mL和4 mL， 送安慶海軍醫院進行血常規和血液生化檢測。

1.5 藥敏試驗

采用Kirby-Bauer擴散法， 選取阿莫西林、阿米卡星、頭孢曲松鈉等抗菌藥物對分離致病菌做藥物敏感性測定， 具體做法及敏感性判定， 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2010年制定的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準； 第二十版信息增刊》[11]。

1.6 治療方案制定

治療方案的制定， 綜合考慮多種因素， 本病例主要采取起水輸液的方式對患病江豚進行治療。初期因部分診斷結果耗時較長， 因此， 前期以對癥治療為主， 針對本患病江豚存在的問題主要通過使用一些能量合劑和提高機體免疫力的藥物來使患病江豚快速恢復體能和維持自身需求。通過細菌分離鑒定及血常規檢測結果， 確定細菌性疾病感染時， 參照藥敏試驗結果， 優先選擇一些分別針對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的廣譜抗生素進行治療。藥物使用途徑， 前期以靜脈滴注為主， 待患病江豚食欲大部分恢復后改為口服給藥。除此之外，整個治療方案的制定還應將江豚護理考慮在內， 做好包括輸液全程呼吸頻率監測、用藥后反應情況觀察、定時澆水等工作。

2 結果

2.1 病原菌的分離鑒定

呼吸孔微生物樣品接種培養純化后， 在血平板培養基上生長良好， 菌落呈乳白色， 表面光滑濕潤，呈革蘭氏陰性菌， 單個或成對存在， 菌體大小(0.3—0.5) μm×(0.6—1.2) μm(圖 1)。樣品經Baird-Parker瓊脂平板培養， 大量且比較均一的菌落長出， 菌落呈圓形， 黑色， 染色鏡檢可見呈葡萄串樣排列的革蘭氏陽性球菌(圖 2)， 與血平皿和TSA平板培養基分離的陽性球菌屬于同1種菌。

對純化后的菌液進行PCR擴增， 得到1條約1500 bp大小的目標片段， 與測序結果基本一致(1449 bp和1453 bp， 見附件1和2)。將序列在NCBI上經Blast進行同源性比對， 結果顯示， 分離的革蘭氏陽性球菌與金黃色葡萄球的序列同源性最高， 相似性高達97%， 分離的革蘭氏陰性桿菌與魔氏摩根菌的序列同源性最高， 相似性高達98%， 綜合細菌形態學鑒定結果， 可確定從患病江豚呼吸孔分離到的致病菌為金黃色葡萄球和魔氏摩根菌。

2.2 血樣檢驗

圖 1 革蘭氏陰性菌分離株菌落及菌體形態Fig. 1 The Colony and morphology of the strains of Gram-negative bacteria

圖 2 革蘭氏陽性菌分離株菌落及菌體形態Fig. 2 The Colony and morphology of the strains of Gram-positive bacteria

以江豚尾靜脈采取的血液為材料， 對病程中的江豚分別進行了3次血常規和血液生化指標檢測，并與發病前健康血象指標進行比較(表 1、表 2)， 血常規檢測結果顯示， 白細胞總數明顯升高， 中性粒細胞百分比也由發病前的46.2%升高到91%， 淋巴細胞百分比明顯降低， 由發病前的28.9%下降到5.8%， 表明江豚機體有炎癥。另外， 平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度明顯升高， 揭示機體有脫水現象。紅細胞數量輕微下降不排除機體內臟器官有出血或敗血癥的可能。此外， 血常規檢測結果還顯示單核細胞百分比和嗜酸性粒細胞百分比明顯降低， 預示機體免疫功能有降低趨勢。血清生化檢測結果顯示， 總膽紅素與間接膽紅素， 谷丙轉氨酶和堿性磷酸酶4項指標升高， 提示肝臟可能損傷， 而尿酸升高及肌酐降低， 也預示患病江豚腎功能有異常。血常規及血清生化檢測結果揭示， 患病江豚發生了嚴重的細菌感染且病情有惡化趨勢， 細菌導致的感染已引起肝臟、腎臟等內臟器官功能異常。

2.3 藥敏試驗

采用Kirby-Bauer擴散法， 選取阿莫西林、阿米卡星、頭孢曲松鈉等抗菌藥物對分離致病菌做藥物敏感性測定， 結果顯示金黃色葡萄球菌對氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松等藥物敏感， 對克林霉素中度敏感， 對紅霉素、四環素、慶大霉素等藥物耐藥； 魔氏摩根菌對多粘菌素B、頭孢曲松、阿米卡星等藥物敏感， 對阿奇霉素、氧氟沙星、鏈霉素中度敏感， 對萬古霉素、慶大霉素、復方新諾明耐藥(表 3、表 4)。

2.4 治療結果

通過對患病江豚致病微生物的分離培養與鑒定， 結合血液檢測結果， 可確診該病是由金黃色葡萄球菌和魔氏摩根菌混合感染引起的嚴重細菌性疾病。在正確診斷的基礎上， 綜合考慮多方面因素制定了治療方案(表 5)。治療結果顯示用藥后第3天， 病情明顯好轉， 江豚拒食現象消失， 可自由采食一部分人工投喂的餌料魚， 并出現水中捕魚行為。至用藥后第8天江豚采食量和行為基本恢復正常， 血液檢測結果接近該江豚發病前健康狀態參數(表 1、表 2)。此外， 為減少離開水面對江豚造成的應激和避免意外發生， 江豚起水輸液治療過程中，除保持輸液室內合適的溫度和空氣流通外， 還對江豚進行了包括定時向其呼吸孔和皮膚澆水、緊張按摩、呼吸頻率監測(表 6)等在內的多種護理行為。行為觀察結果顯示除治療第1天， 江豚有比較劇烈的掙扎行為， 稍有緊張以外， 從治療第2天， 尤其是從第3天開始江豚表現相當溫順， 基本不需要人員保定。江豚呼吸頻率監測結果顯示， 治療前2天江豚呼吸頻率分別為(24.2±17.5)次/s和(28±14.3)次/s， 較水中呼吸頻率(36.8±26.4)次/s用時較短， 說明江豚治療前兩天有緊張表現， 從第3天開始，江豚呼吸頻率趨于穩定并與水中自由活動的呼吸頻率相當， 這與江豚的行為表現相一致， 說明江豚適應了整個治療過程。

表 1 江豚血常規指標Tab. 1 Hematology values of the Yangtze finless porpoise

3 討論

長江江豚是目前生活在長江中下游及通江湖泊的唯一淡水豚類， 目前生存狀況不容樂觀。遷地保護作為目前長江江豚保護的重要舉措之一， 在種群繁育、科學研究等方面發揮了積極作用。但在遷地保護過程中， 由于環境變化和應激反應等因素導致的江豚疾病問題應值得關注。研究發現， 江豚等鯨類動物一旦從遼闊的海洋或大型江河轉入人工環境或小型水域進行飼養， 由于多種條件的改變和應激因素的存在， 極易誘發多種疾病且在轉移后的幾個月死亡率極高[8，9，12]。我國飼養江豚的歷史由來已久， 盡管多次進行過白鱀豚和江豚的人工豢養， 但有相當一部分以失敗而告終， 繁殖成功的案列更是少之又少[13—15]， 導致失敗的原因大多歸于疾病， 其中消化系統疾病和呼吸系統疾病最為常見且危害最大[8， 9， 12， 15， 16]。

表 2 江豚血液生化指標Tab. 2 Biochemistry values of the Yangtze finless porpoise

表 3 金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果Tab. 3 Drug sensitivity test of Staphylococcus aureus

注: “S”表示敏感； “I”表示中度敏感； “R”表示耐藥Note: S-sensitive； I-inhibition； R-resistant

表 5 治療方案Tab. 5 Therapeutic schedule

長江江豚等水生動物的疾病診斷與陸生動物相類似， 但難度更大， 需利用多種方法進行綜合確診， 本文雖然分離到了金黃色葡萄球菌等致病菌，但這些菌大多為條件性致病菌， 在健康動物體內時常也可檢測到[17]， 只有當動物持續受到應激刺激，導致抵抗力下降后才可引發疾病， 因此， 要對本病例進行確診， 還要參考其他診斷方法。臨床視診作為疾病診斷的常用方法， 對于陸生動物尤其是臨床癥狀比較典型的患病動物具有十分重要的診斷意義， 因長江江豚在感染疾病后， 除表現一般的臨床癥狀外， 大多臨床表現不典型， 所以臨床視診對于江豚疾病診斷意義不大。血液學診斷在人類和小動物疾病診斷中發揮重要作用， 通過血液檢測可快速對病性以及各器官的損傷程度進行確診， 該方法對江豚疾病診斷同樣較為實用， 正確診斷的前提條件是有患病江豚健康時血液基礎參考值。本研究通過細菌分離鑒定到兩株致病菌， 血液檢測結果呈細菌感染指征， 抗生素治療有效且預后良好， 多種診斷方法確診江豚感染了細菌性疾病， 且致病菌為金黃色葡萄球菌和魔氏摩根菌。

表 6 江豚治療期間呼吸頻率監測Tab. 6 The respiratory rate during therapy

金黃色葡萄球菌， 隸屬于葡萄球菌屬， 是一種重要的病原菌， 廣泛存在于自然環境中， 可感染多種動物， 是一種重要的人獸共患病[18—21]。鯨類動物也有感染金黃色葡萄球的報道[22—25]， 且感染以后多呈肺炎經過[26]。魔氏摩根菌， 為革蘭氏陰性桿菌，毒力較強， 可感染水龜、大鯢、錦鯉等水生動物，感染后可引起皮膚潰爛、敗血癥、肺炎、心包炎、腦膜炎、關節炎等[27—29]。對于2株細菌的致病性本文并未涉及， 后期可通過感染模式動物或魚類對其感染性和致病力進行評價。

細菌性疾病的治療原則以對癥治療和抗生素治療相結合， 國內外獸醫臨床工作者也多采用這種方法對患細菌病的江豚或海豚進行治療且效果良好[15，30—32]。本病例治療方案的制定綜合考慮了多種因素， 由于缺乏長江江豚用藥參考， 藥物選擇方面多參考人藥和小動物用藥， 抗生素優先選擇一些針對性強且安全系數高的藥物， 注意輪換用藥， 防治耐藥性產生， 對于一些必選且容易產生副作用的藥物比如氨芐西林， 除了配伍抗過敏藥物地塞米松磷酸鈉注射液以外， 用藥過程中還應密切關注動物反應， 一旦出現問題， 應及時終止。藥物劑量把控方面， 多參照每種藥物的安全劑量以每公斤體重進行換算， 治療初期劑量稍大， 后期根據需要適當減少。本病例由于感染非常嚴重且江豚食欲廢絕無法通過口服給藥， 為了達到較快療效， 用藥途徑采取靜脈滴注和肌肉注射相結合， 抗生素也盡可能選擇一些殺菌機理不同的藥物。關于江豚輸液量的確定， 一般是根據丟失量加代謝需要量進行計算，但因無法對其評估， 所以這方面的工作還有待于進一步摸索， 目前僅能參考陸生動物。另外， 在江豚輸液過程中， 精心護理至關重要， 其目的是最大程度減少江豚應激和保證順利完成輸液。輸液過程中應認真做好以下工作: (1)定時澆水， 刺激江豚呼吸和防止其皮膚過于干裂； (2)密切關注其呼吸頻率和行為， 有憋氣現象應適當對其進行按摩或捶打；(3)保持治療室內合適的環境溫度和通風； (4)根據藥物性質和江豚反應合理控制輸液速度。通過本次治療發現江豚的適應能力特別強， 藥物治療效果也比較顯著， 輸液療法完全可以作為一種安全有效的技術手段用于江豚疾病的治療。

疾病問題是江豚遷地保護區將來面臨的主要問題之一， 積極進行長江江豚疾病的病原學研究，研制出可用于江豚疾病預防或診療的生物制品具有重要的意義。此外， 許多動物疾病的發生與飼養管理不善息息相關， 因此各遷地保護區應加強保護區的人員管理和培訓， 以更加科學合理的方法對江豚進行保護。

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