過敏性鼻炎患者肺虛感寒證和腎陽虧虛證血清代謝組學研究*

梁 薇 ，楊 艷，李曉燕 ，趙 創 ，茍小軍

過敏性鼻炎（AR）是由于鼻腔黏膜發生變態反應而引起的疾病，所以又稱變應性鼻炎[1]，AR為耳鼻喉臨床科常見病、多發病。近年來，AR的發病率呈現逐年上升的趨勢，全球發病率為10%～25%[2]，中國 AR 患病率為 8．7%～24．1%[3]。AR 在祖國醫學中屬于“鼻嚏”、“鼻鼽”、“鼽嚏”的范疇。“肺氣虛則鼻塞不利”，肺開竅于鼻，鼻有賴于肺氣的充養，故肺病可引觸鼻病;腎為先天之本，諸陽之根，主納氣。先天稟賦不足，或后天久病傷腎，腎陽不足，肺失溫煦，易感外邪。此情況多出現肺脾腎三臟陽氣虧虛，寒水上泛而不能制，尤易受風寒異氣之刺激而發病。鼻的正常生理功能的發揮依賴腎的精氣充養，如果陽氣不足，不能溫化水飲，寒濕上泛，則使鼻流清涕，可見腎氣不足，肺失溫養，可導致鼻鼽的發生。西醫多采用抗生素或激素治療AR，雖然效果顯著，但不能從根本上解決問題；而中醫采用整體論治和辨證治療AR，療效顯著，并且積累了大量的臨床經驗，與西醫相比，有獨特的優勢，但中醫辨證治療AR存在許多的問題，缺乏科學嚴謹客觀的評價標準，使得中醫辨證治療AR的臨床療效不能被很好的證實，嚴重制約了中醫臨床研究與國際接軌，如何使中醫辨證治療得到客觀化、可視化，已經成為目前中醫研究的熱點問題。

代謝組學是研究生物體受到刺激或擾動后，所有低分子量的代謝產物隨時空變化的一種組學方法[4]，是一種整體系統的研究技術，在方法學上具有融整體、動態、綜合、分析于一體的特點，與中醫學的整體觀念和辨證論治思維模式上存在天然的一致性，兩者均表現的是致病因素與機體反應共同的結果，為中醫證候研究提供了新的思路和方法[5]。因此，本研究采用氣相色譜質譜聯用（GC/MS）技術，進行AR患者肺虛感寒證和腎陽虧虛證患者血清代謝組學研究，尋找AR不同中醫證候患者的血清中特異性代謝產物的變化，有可能為中醫辨證的客觀化、定量化開辟一條新途徑，對中醫證候的規范化、現代化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有AR患者均來自于2016年10—12月上海市寶山區中西醫結合醫院針灸門診患者。本研究患者14例作為肺虛感寒組，其中男8 例，女 6 例，患者平均年齡（44．46±4．94）歲；6 例作為腎陽虧虛組，其中男3例，女3例，患者平均年齡（47．55±5．14） 歲；20 例健康人作為對照組，其中男10 例，女 10 例，平均年齡（46．12±5．63）歲，3 組性別、年齡等基本資料比較，差異無統計學意義（P＞0．05），具有可比性。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 參照2009年中華醫學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會組制定的《變應性鼻炎診斷和治療指南》推薦的標準[6]。

1.2.2 中醫辨證標準 參照1994年國家中醫藥管理局發布的《中醫病證診斷療效標準》[7]中的肺虛感寒證和腎陽虧虛證辨證標準。

1.2.3 納入標準 年齡18～65歲之間的門診或住院患者；性別不限；凡符合西醫AR診斷標準及中醫肺虛感寒證和腎陽虧虛證辨證標準，簽署知情同意書者。

1.2.4 排除標準 合并有嚴重的肝腎功能不全、心臟病、腦血管病、糖尿病等；其他過敏性疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 血清采集 叮囑研究對象在樣本收集前3 d清淡飲食，避免食用海鮮以及辛辣食物，以減少食物對代謝造成的波動。研究對象集中到門診，由工作人員抽取早晨空腹的血液5 mL，置于離心管中密封，記錄標號，-4℃冰箱靜置1 h，然后離心，吸取上清液，于-80℃冰箱冷凍保存，待檢測。

1．3．2 試劑與儀器 BSTFA+1%TMCS，雙三甲硅基三 氟 乙 酰 胺 [N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetam ide]，購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號:B0830；鹽酸甲氧胺（methoxyamine hydrochloride），購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：M0343；2-氯苯丙氨酸、十七碳酸、吡啶、甲醇皆為分析純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氣相色譜/質譜聯用儀（7890A/5975C，安捷倫科技有限公司）；氣相毛細管色譜柱（HP-5MS，5%苯/95%甲基聚硅氧烷 30 m×250 μmi．d．，0．25 μm film thickness，Agilent J&WScientific，Folsom，CA，USA）；冷凍離心機（H1650-W，Eppendor f）；混勻儀（QL-866，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；鼓風干燥箱（D HG-9240，Y iHe ng）；真空離心濃縮儀（Eppendorf 53050）。

1.3.3 血清樣品前處理 實驗前2 h，將所有樣本在4℃下融化；取樣本100μL于1．5 mL離心管中，加入400μL甲醇，振蕩60 s，充分混勻；加入60μL十七碳酸（0．2 mg/mL）作為內標，渦旋振蕩 60 s；在12 000 r/min 4℃離心10 min，取全部上清液轉移到新的1．5 mL離心管中，樣品用真空離心濃縮儀濃縮至干；加入60μL鹽酸甲氧胺溶液渦旋振蕩30 s，在37℃條件下反應2 h；最后加入60μLBSTFA試劑（雙三甲硅基三氟乙酰胺，含1%三甲基氯硅烷，37℃條件下反應90 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液加入到檢測瓶中。

1.3.4 GC/MS分析條件 色譜及質譜參數如下：系統載氣及流速：進樣量1μL，分流比20∶1，氦氣1 mL/min，進樣口溫度280℃；離子源溫度230℃；接口溫度150℃；升溫程序以60℃為初始溫度，持續2 min，以10℃/min的速率上升到300℃并在300℃停留5 min，溶劑延時5 min；電離方式EI；電子能量70 eV；質譜掃描范圍：m/z35-780；全掃描方式。

1.3.5 數據處理與模式識別方法 原始GC/MS數據文件，通過Agilent MSDChemStation工作站轉換成NetCDF格式，然后導入到R3．3的XCMS程序包中進行峰識別、峰過濾、峰對齊等過程，最終得到1個保留時間、質荷比和峰強度組成的三維矩陣表，將三維矩陣導入 SIMCA-P11．5 軟件（Umetrics，Swed en）中進行多維統計分析。采用非監督的主成分分析（PCA）和監督分析法如正交偏最小二乘法（OPLSA）建模，尋找造成樣本聚集和離散的主要差異變量?；诓町惐磉_的代謝物鑒定，主要是結合AMDIS程序進行，利用National Instituteof Standards and Technology（NIST）商業數據庫和 Wiley Registry代謝組數據庫及本實驗室建立的標準品代謝物譜庫。

2 結果

2.1 代謝指紋圖譜宏觀分析 比較正常對照組、肺虛感寒組和腎陽虧虛組樣本的典型血清總離子色譜圖，宏觀上觀察到這3組的代謝指紋圖譜有細微的差異，主要是峰強度有一定的差異，結果見圖1。

2.2 代謝譜分析 為了觀察所有樣本的大致趨勢以及樣本的自然分布和組別關系，發現聚類和奇異點，首先使用非監督的P CA，分別分析了正常對照組、肺虛感寒組和腎陽虧虛組的血清代謝譜，結果顯示，在無監督狀態下各組血清代謝物譜不能區分，交叉聚集，結果見圖2。為了進一步篩選AR不同證型分類的關鍵變量，對各組數據進行了三維的PLS-DA分析，經7次重交叉驗證，模型的R2Y=0．71，Q2Y=0．17，分類結果如圖 3 所示。

圖1 血清GC/MS總離子流色譜圖Fig.1 GC/MStotal ion chromatogram of serum

2.3 差異代謝物的分析 基于PLS-DA分析結果，依據權重系數 VIP＞1，相關系數的閾值|r|＞0．4，P＜0．05，測得的差異代謝物，單維上進行驗證（t-test檢驗，P＜0．05），結合 AMDIS 程序，利用 NIST 商業數據庫和Wiley Registry數據庫及本實驗室建立的標準品代謝物譜庫，鑒定了23個差異代謝物，并進行了相對濃度單維上變化情況的考察，結果見圖4和表1。

3 討論

圖2 AR肺虛感寒組、腎陽虧虛組和正常對照組血清代謝PCA得分圖Fig.2 Serum metabolic PCA score map of control group，lung deficiency and cold syndrome and kidney-yang deficiency syndrome in AR

本研究采用基于GC/MS技術的血清代謝組學方法，進行AR患者肺虛感寒證和腎陽虧虛證血清代謝譜研究，PLS-DA方法能夠區分AR肺虛感寒證、腎陽虧虛證和正常對照組的代謝譜，而且這2個證型之間也可以區分。經多維和單維統計分析，獲得了丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等6個與肺虛感寒證、腎陽虧虛證密切相關的潛在標志物，這些標志物含有特定的生物學內涵。

首先，血清中找到的與氨基酸代謝有關的有統計學差異的標志物是丙氨酸。

丙氨酸在體內經血液運到肝臟，通過聯合脫氨基作用生成氨和丙酮酸，丙酮酸經糖異生途徑生成葡糖糖，因此，丙氨酸是葡萄糖循環途徑中的重要參與者與調控者，其代謝異常與腎小球的濾過和回收功能有關[8]。本研究中，肺虛感寒證組的丙氨酸含量比腎陽虧虛證組低。說明肺虛感寒證組比腎陽虧虛證組存在更嚴重的氨基酸代謝紊亂。

圖3 AR肺虛感寒組、腎陽虧虛組和正常對照組血清代謝PLS-DA得分圖Fig.3 Serum metabolic PLS-DA score map of control group，lung deficiency and cold syndromeand kidneyyang deficiency syndrome in AR

圖4 AR肺虛感寒組、腎陽虧虛組和正常對照組血清代謝V-Plot圖Fig.4 Serum metabolic V-Plot map of control group，lung deficiency and cold syndromeand kidney-yang deficiency syndrome in AR

表l關鍵代謝物的名稱及其變化Tab.1 Nameof key metabolitesand their changes

本研究還發現十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等一些脂肪酸發生了變化。脂肪酸是最基本的脂質成分，主要由脂類物質的分解產生和其他物質的分解轉化而成。脂肪酸根據有無雙鍵及其數目，可分為3大類：飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸，不同的脂肪酸可能具有不同的作用，可能有的對機體起保護作用，有的對機體產生危害[9]。據報道，脂代謝異常導致血中脂肪酸增加，而脂肪酸的升高可以通過溶酶體途徑使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達增加，脂肪酸導致Bax易位于溶酶體，組織蛋白酶從溶酶體易位于胞漿，最后溶酶體破裂，核轉錄因子-κB（NF-κB）降解，釋放出 NF-κB，定位到核內，激活 TNF-α 并且 TNF-α、白介素-6（IL-6）與脂肪酸呈正相關[10-11]。在炎性疾病中TNF-α扮演著重要的角色，特別是AR患者，其鼻黏膜下組織中巨噬細胞、肥大細胞、單核細胞等數量均相對較多，其均可生成TNF-α，因此，AR的發病與TNF-α有關系[12]。而IL-6作為細胞因子，其擁有多功能，其在炎癥反應、免疫應答等方面均扮演著重要的角色。IL-6是通過單核、巨噬細胞等誘導下出現的細胞因子，可直接激活血管內皮細胞與炎性細胞，具有一定的毒性，還可促進急性期蛋白合成，從而進一步增加了炎性反應。IL-6能夠調節IgE免疫應答，還可以上調黏附分子的表達，參與多種白細胞黏附與聚集，也可以加強炎癥反應[14]。Omega-3來自深海魚油，其主要成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），DHA和EPA主要是通過PPARα-IκB-NFκB的信號通路影響炎癥信號傳遞。EPA或DHA與PPARs結合后啟動抑制蛋白I-κB的基因表達，在細胞質中I-κB與NF-κB結合使后者處于非活性狀態，從而抑制NF-κB介導促炎信號的傳遞[15]，Omega-3多不飽和脂肪酸能夠抑制炎性細胞因子的分泌從而降低病理性炎性反應[16]，Omega-3能影響脂肪乳劑代謝的中間產物-花生四烯酸的代謝，使其產生前列腺素和系列白三烯產物，從而有助于下調過度的炎癥反應，促進巨噬細胞的吞噬功能，改善機體的免疫機制[17]。以上研究表明，脂肪酸在AR的發病中有很重要的作用，本研究中，肺虛感寒證組的十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸含量均比腎陽虧虛證組低，說明肺虛感寒證組比腎陽虧虛證組存在更嚴重的脂肪酸代謝紊亂。

兩種中醫證型的共同特點是與氨基酸代謝和脂肪酸代謝異常相關，反映了機體在各因素綜合作用下的終端效應，是各個因素效應的綜合體現，但是兩種中醫證型之間又有不同的代謝特點，其中丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸的相對含量在兩種證型間有統計學差異，使得AR兩證型在臨床鑒別中有了可靠的客觀化及量化的依據。由此說明，本試驗使用GC/MS的代謝組學方法能夠全面反映肺虛感寒證、腎陽虧虛證AR患者的代謝共性和各自特征，代謝組學分析技術可運用于臨床不同中醫證型的分類研究。

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（收稿日期：2017-12-16）