消瘰丸治療淋巴瘤基于PD-1/PD-L1信號通路的機制研究*

劉群英 ，張 博 ，李海燕，董 雷 ，孫超逸 ，楊明珠，孫 凇 ，倪 磊

惡性淋巴瘤（ML）原發于淋巴結或結外淋巴組織，分為霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）兩大類。臨床常見淺表淋巴結彈性腫大，常與皮膚不粘連，可累及多處淋巴結，一般無痛性，臨床上出現的少數疼痛，多是由于壓迫神經引起。20世紀，歐美以及中國等國家的淋巴瘤病死率已經進入癌癥病死率前10位，近年來其發病率有上升趨勢[1]。目前主要有化療、放療、手術以及造血干細胞移植等臨床手段治療淋巴瘤，對各種生物靶向制劑和化療藥物的耐藥性使得淋巴瘤的治療過程中副反應明顯，容易復發而且病死率高[2-3]。針對淋巴瘤的一些西藥的療效并不明顯，治療過程中常表現為易復發，化療敏感性差，預后不良[4-5]。既往認為外周T細胞性淋巴瘤的標準治療方案是CHOP方案（環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松）或者是CHOP類化療方案，這種方案除了對間變性大細胞淋巴瘤（淋巴瘤激酶陽性）療效突出外，對其他外周T細胞性淋巴瘤的療效并不突出，應用此方案治療的淋巴瘤患者，其3 a總生存期率僅為52%[6]。不理想的治療效果使得醫學工作者加強基礎研究，積極探尋淋巴瘤的病因和機制，但其機制至今都未完全闡明。在淋巴瘤分子生物學機制研究進展中，經典Wnt/βcatenin信號通路、程序性死亡因子（PD-1）/程序性死亡因子配體1（PD-L1）信號通路、cAMP信號通路、Notch信號通路等等，與淋巴瘤發病機制密切相關，其中PD-1/PD-L1信號通路尤為引人關注[7]。

古方消瘰丸，源于《醫學心悟》，由貝母、牡蠣、玄參三味藥1∶1∶1組成，是中醫基于消瘰散結法治療惡性淋巴瘤的常用方。有學者在對中醫藥治療淋巴瘤常用方劑的整理研究中發現，消瘰丸在中醫治療淋巴瘤常用方劑中使用率居首位[8]。同時在臨床中發現，消瘰丸對淋巴瘤確實具有比較積極的療效[9-10]。但該方究竟對T/B細胞免疫調節中哪些環節起作用以及其作用機制尚不明確。本實驗初步探究消瘰丸治療淋巴瘤T細胞在PD-1/PD-L1信號通路上的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 正常人淋巴細胞外周血由北京紅十字會血站提供，淋巴瘤患者外周血來自北京中醫藥大學東直門醫院淋巴瘤患者。正常人和淋巴瘤患者淋巴細胞外周血用Fico/Lite LymphoH淋巴細胞分離液得到外周血單個核細胞（PBM C），然后調整成細胞數為5×106/mL的細胞懸液。

1.1.2 主要試劑與儀器 消瘰丸制劑（北京中醫藥大學東直門醫院加工制備為細胞培養用制劑）、細胞培養液（10 000 U/mL青鏈霉素雙抗0.1%、L-谷氨酰胺1%、RPMI-1640培養基89.9%、胎牛血清10%）、Fico/Lite LymphoH淋巴細胞分離液、CCK8檢測試劑盒 (日本同仁化學研究所）、Cell Trace CFSE細胞增殖試劑盒（Invitrogen公司）、PE-PD-1（e Bioscien ce公司）、Fitc-PD-L1（e Bioscience公司）、Fitc-CD4（e Bioscience 公司）、Fitc-CD8（e Bioscience公司）、APC-CD69（e Bioscience公司）、APC-CD20（e Bioscience公司）、APC標記的鼠抗人 Isotype（e Bioscience公司）、T/B生長刺激劑、1640培養基（Invitrogen公司）、流式細胞儀（Becton Dickinson公司，FACSCalibur）。其他為常用試劑。

1.2 方法

1.2.1 分離淋巴細胞 健康人與淋巴瘤患者外周血收集后，經肝素抗凝，用Fico/Lite LymphoH淋巴細胞分離液得到外周血單個核細胞（PBMC），用1640細胞培養液調整成細胞懸液，細胞數為5×106/mL。

1.2.2 CCK8檢測細胞活性 接種的細胞懸液（每孔100μL）于96孔板中，將培養板放在37℃、5%CO2孵育箱中預培養4 h，分別加入消瘰丸溶液不同梯度濃度，在其他條件相同的情況下培養36 h，然后培養板每孔加入20μLCCK8再次培育1 h后，用酶標儀測定其吸光度，觀察細胞增殖情況，計算OD值。根據OD值來選擇最適濃度。為保證實驗的可靠性，重復至少3次實驗。

1.2.3 CFSE標記 將2μL 5 mmol/LCell Trace CFSE溶于18μL二甲基亞砜DMSO，制成2.5 mmol/LCFSE儲存液。向1 mL健康人和淋巴瘤患者的PBMC細胞懸液中分別加入2μL CFSE儲存液，37℃、5%CO2孵育箱染色10 min，用RPMI-1640培養基洗2次，棄盡液體，然后用800μL細胞培養液制成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μL，每例各兩孔。

1.2.4 細胞刺激、培養與標記 向每例兩孔中的一孔中加入2μL消瘰丸（0.01 g/L），另一孔中加入10μLPD-L1抗體，各孔中加入PHA刺激。在37℃，體積分數為5%CO2培養箱中培養72 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，用100μLPBS混懸細胞。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，加入5μL不同細胞表面活性抗體（C D4、CD8、CD69、Isotye、CD20），用 PBS洗滌2次。

1.2.5 流式細胞儀（FCM）測定 以APC標記的鼠抗人Isotype標記的細胞為陰性對照，在流式細胞儀上以488 nm為第一激光、633 nm為第二激光激發熒光，在513 nm帶通濾鏡進行FITC標記的測定，在575 nm帶通濾鏡進行PE標記的測定，在660 nm帶通濾鏡進行APC標記的測定。通過 BD Cell Quest Pro軟件分析數據，以APC-CD20陽性細胞設定門，選定T細胞作為檢測細胞，以CFSE通道的組合觀察CD4+T細胞、CD8+T細胞增殖情況，及消瘰丸干預后CD4+T細胞、CD8+T細胞增殖的變化。

2 結果

2.1 消瘰丸對淋巴細胞的作用以及最適濃度 已知CCK8檢測原理，OD值越大，細胞數目越多，故濃度和OD值成負相關。如圖1所示消瘰丸藥物干預淋巴細胞，抑制細胞的活性，其最適濃度約為0.01 g/L。

2.2 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤CD4+細胞與CD8+細胞PD-1表達變化 如圖2所示，T淋巴瘤細胞在消瘰丸干預下，CD4+T細胞PD-1（+）表達下降而CD8+T細胞PD-1（+）表達升高，由于CD8+T細胞是具有細胞毒性的淋巴細胞，說明消瘰丸對T淋巴瘤細胞大量異常增殖的T細胞中PD-1/PD-L1信號通路存在影響，可以抑制CD4+T細胞膜表面PD-1（+）的高表達，并提高CD8+T細胞膜表面PD-1（+）的表達。

2.3 T細胞淋巴瘤淋巴細胞阻斷成功檢驗 加入PD-1配體阻斷劑后，CD4+T細胞PD-1表達增高，說明CD4+T細胞中，與PD-L1結合的PD-1位點更多地暴露出來，故PD-1（+）表達增加，說明阻斷劑有效，阻斷成功，如圖3所示。

2.4 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤CD4+和CD8+細胞活性變化 CD69可產生細胞內信號傳導及多種免疫反應，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在激活的淋巴細胞上表達，是淋巴細胞活化的細胞表面標志物。

2.4.1 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤CD4+和CD8+細胞活性作用 如圖4所示，加入消瘰丸后T淋巴瘤細胞中CD4+T淋巴細胞CD69表達降低，而CD8+T淋巴細胞CD69表達升高。由于CD69是T細胞表面活性的標記，CD69表達降低，說明消瘰丸對T細胞淋巴瘤大量異常增殖的T淋巴細胞中CD4+細胞活性有抑制作用而對有細胞毒作用的CD8+細胞活性有增強作用。

圖1 消瘰丸干預淋巴細胞活性結果Fig.1 Theresultsof thelymphocyteactivity investigated by Xiaoluo pill

圖2 消瘰丸干預淋巴瘤T細胞CD4+細胞與CD8+細胞PD-1表達變化結果Fig.2 Theresults of the expression of PD-1 of CD4+and CD8+of lymphoma T cellsinvestigated by Xiaoluo pill

圖3 加入PD-L1前后CD4+T細胞PD-1表達結果Fig.3 The resultsof theexpression of PD-1 of CD4+of lymphoma T cellsbefore and after adding in PD-L1

圖4 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤CD4+和CD8+細胞活性變化結果Fig.4 The resultsof thecytoactive of CD4+and CD8+of lymphoma T cellsinvestigated by Xiaoluo pill

2.4.2 消瘰丸對T細胞淋巴瘤CD4+細胞活性干預作用與PD-1/PD-L1通路相關性 阻斷PD-1配體同時加入消瘰丸，對比單純阻斷PD-1配體和單純加入消瘰丸，T淋巴瘤細胞中CD4+T淋巴細胞CD69表達降低的更為明顯，實驗結果顯示阻斷PD-1配體，大量PD-1受體暴露后，加入消瘰丸對T細胞淋巴瘤大量異常增殖的T淋巴細胞中CD4+細胞CD69抑制作用比單純阻斷PD-1配體和單純加入消瘰丸都明顯。說明消瘰丸對T細胞淋巴瘤大量異常增殖的T淋巴細胞中CD4+細胞活性的抑制作用可以通過PD-1/PD-L1起作用，結果如圖5所示。

2.4.3 消瘰丸對T細胞淋巴瘤CD8+細胞活性干預作用與PD-1/PD-L1通路相關性 具有細胞毒作用的CD8+T細胞，加入阻斷劑或者加入消瘰丸后其活性增加，加入消瘰丸的作用更為明顯，而同時加入兩者，與單獨加入消瘰丸組相比，增加并不明顯。說明消瘰丸可以通過調節CD8+亞群的活性，但不能認為對于CD8+亞群所有細胞活性的調節與PD-1/PDL1通路相關。見圖6。

2.5 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤PD-1（+）淋巴細胞活性變化

2.5.1 消瘰丸干預對CD4+PD-1（+）細胞活性的變化 CD4+PD-1（+）細胞是CD4+細胞中啟動了死亡程序的異常細胞，這部分細胞的活性降低意味著其對于T細胞淋巴瘤患者機體負面影響的減弱。如圖7所示，單獨加入消瘰丸或者PD-L1阻斷劑可以降低 CD4+PD-1（+）細胞活性（CD69表達），而同時加入兩者，其活性下降更為明顯，說明消瘰丸與PDL1阻斷劑兩者對于CD4+PD-1（+）細胞活性（CD69表達）有協同降低的作用，消瘰丸降低CD4+PD-1（+）細胞活性的作用除了PD-1/PD-L1通路外還有其他通路的參與。

2.5.2 消瘰丸干預對CD8+PD-1（+）細胞活性的變化 CD8+具有細胞毒作用，能夠有效地清除與抗原相關的目標細胞，在T細胞淋巴瘤的免疫調控中具有積極意義。CD8+PD-1（+）細胞是CD8+細胞中啟動了死亡程序、狀態不佳的細胞，這類細胞活性的增強能夠更有效的清除異常細胞。實驗結果如圖8所示，單獨加入消瘰丸或者PD-L1阻斷劑可以增加CD8+PD-1（+）細胞活性（CD69表達），而二者聯合使用后，其活性增加較單獨加入消瘰丸或者PD-L1阻斷劑都低，說明消瘰丸對于CD8+PD-1（+）細胞活性（CD69表達）的增加與PD-1/PD-L1通路相關，并且與PD-1的配體PD-L1有依賴作用。

2.5.3 消瘰丸對T細胞淋巴瘤CD4+/CD8+比值的影響 CD4+/CD8+比值的下降，說明CD4+T淋巴細胞減少的同時CD8+T淋巴細胞增多，這是消瘰丸藥物干預的主要調節作用，而其中的主要信號通路是通過PD-1/PD-L1來實現的。見表1。

圖5 消瘰丸干預CD4+細胞活性與PD-1/PD-L1通路相關性結果Fig.5 Thecorrelation between CD4+cell activity and PD-1/PD-L1 pathway investigated by Xiaoluo pill

圖6 消瘰丸干預CD8+細胞活性與PD-1/PD-L1通路相關性結果Fig.6 Thecorrelation between CD8+cell activity and PD-1/PD-L1 pathway investigated by Xiaoluo pill

圖7 消瘰丸對CD4+PD-1(+)細胞活性變化結果Fig.7 The resultsof the cell activity changesof CD4+PD-1(+)cells investigated by Xiaoluo pill

圖8 消瘰丸對CD8+PD-1(+)細胞活性變化結果Fig.8 Theresultsof the cell activity changesof CD8+PD-1(+)cellsinvestigated by Xiaoluo pill

表1 消瘰丸干預T細胞淋巴瘤CD4+/CD8+比值Tab.1 The CD4+/CD8+ratio of lymphoma T cells investigated by Xiaoluo pill

3 結論

PD-1/PD-L1信號通路在淋巴瘤的機制中發揮著重要作用。PD-1在維持T、B細胞穩態方面有關鍵性作用，其在淋巴細胞中持續表達，產生的信號抑制T細胞活化和誘導淋巴細胞凋亡，從而使免疫反應下調[11]。研究發現PD-1是相關性T細胞和血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤的標志之一[12]，后來陸續有研究表明T細胞淋巴瘤組織中PD-1和PDL1的表達增高[13-14]，而且與患者生存期短、化療療效差有關，是T細胞淋巴瘤患者化療療效差及預后不良的指標[15-16]。PD-1/PD-L1信號通路與T細胞功能損傷有關[17]，在多數血液腫瘤中如B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤等中存在PD-1/PD-L1信號通路異常活化[18]。2014年1月，有學者提出應用PD-1抗體來治療淋巴瘤[19]，但PD-1抗體作為單一靶點治療的安全性和有效性尚待進一步評估。

目前治療ML多采用聯合化療，部分Ⅰ、Ⅱ期患者化療、放療結合使用，Ⅲ、Ⅳ期以化療為主，這種療法可使部分惡性淋巴瘤患者存活較長，但對中、高度惡性非霍奇金淋巴瘤患者的療效并不明顯。療效差的原因可能與T淋巴瘤細胞高表達免疫抑制分子，從而逃避機體的殺傷有關。那么，對中醫藥在惡性淋巴瘤治療中的研究就顯得勢在必行。

消瘰丸為消瘰散結法的代表方劑，是中醫治療腫瘤的常用方劑之一，在以免疫功能障礙為主要特征的淋巴瘤免疫治療中發揮著重要作用。免疫治療的目的之一是激活特異性T細胞的殺傷潛力，PD-1和PD-L1均為免疫負調控因子，前者表達于T細胞表面，后者表達于腫瘤細胞表面，兩者結合后可抑制腫瘤特異性T細胞的激活。筆者研究發現，消瘰丸對T淋巴瘤細胞大量異常增殖T細胞中PD-1/PD-L1通路存在影響，對于大量異常增殖CD4+T細胞可以抑制活性，抑制PD-1（+）表達，消瘰丸與PD-L1阻斷劑兩者對于CD4+PD-1（+）細胞活性（CD69表達）有協同降低的作用，說明消瘰丸降低CD4+PD-1（+）細胞活性的作用有PD-1/PD-L1通路的參與，同時還有其他通路的參與。消瘰丸對于有細胞毒作用的CD8+T細胞活性有增強作用，可以促進PD-1（+）的表達。消瘰丸對于CD8+PD-1（+）細胞亞群活性（CD69表達）的增加與PD-1/PDL1通路相關，并且與PD-1的配體PD-L1有依賴作用。

通過此次研究，課題組初步認為消瘰丸對淋巴瘤的免疫調節紊亂具有積極的調控作用。這為中醫藥消瘰散結法對于免疫相關腫瘤的治療具有初步的示范探索意義。

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