靶向Bak1的shRNA表達腺病毒構建及其對人骨肉瘤細胞的影響＊

黃紅 ，柴爽 ，萬雷 ，王吉利 ，黃宏興 △

(1、廣州中醫(yī)藥大學護理學院，廣州 510006；2、廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405；3、廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣州510240)

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)生與成骨細胞主導的骨形成過程和破骨細胞調節(jié)的骨吸收過程密切相關，在骨重建過程中，吸收的骨量多于形成的新骨，造成骨重建脫偶聯(lián)，是骨質疏松發(fā)生的病理基礎[1]。成骨細胞對骨組織的代謝平衡、生長發(fā)育和損傷修復起主要作用。在骨形成過程中，成骨細胞要經(jīng)歷增殖、分化、和凋亡三個階段[2]。研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞凋亡在骨質疏松癥的發(fā)病過程中起著非常重要的作用[3-5]。眾多關于細胞調亡的研究提示Bcl-2（B-cell lymphoma-2）蛋白家族是調控細胞線粒體調亡途徑的關鍵因子，Bak1（BCL2-antagonist/killer 1）作為Bcl-2家族的促凋亡蛋白，對線粒體凋亡途徑中線粒體外膜的通透化至關重要[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與非骨質疏松癥患者相比，骨質疏松癥患者松質骨Bak1的表達明顯升高，Bak1與腰椎骨密度成負相關[7]。本研究擬構建沉默Bak1的重組腺病毒載體，轉染人骨肉瘤細胞MG63，并檢測沉默Bak1對細胞活性的影響，為進一步研究Bak1在骨質疏松骨形成中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及菌株 人成骨肉瘤細胞(MG63，由中國科學院上海細胞所細胞庫提供）、One Shot Stbl3TME.coli感受態(tài)細胞 （美國Invitrogen公司），DH5α感受態(tài)細胞（北京鼎國生物技術有限責任公司）。

1.1.2 工具酶及主要試劑AgeⅠ、EcoRⅠ、PacⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶 （美國NEB公司），Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent、 逆 轉 錄 試 劑盒、熒光定量PCR試劑盒、BP Clonase II enzyme mix、LR Clonase II enzyme mix(美國 Invitrogen 公司)，膠回收/純化試劑盒、質粒小提試劑盒（中國天根公司），RIPA細胞裂解液 （美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、Pen/Strep、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司），Bak(D4E4)Rabbit mAb（美國 CST公司），HRP-Goat Anti-Mouse IgG （美國Jackson公司）。

1.2 方法

1.2.1 shRNA腺病毒載體的構建 ⑴發(fā)卡樣寡核苷酸序列的設計與合成：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的人Bak1基因(Genebank ID：578)序列，運用 Primer 5.0設計PCR引物，設計3條相對應的短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列，每條鏈由正義鏈、Loop、反義鏈和終止信號TTTTT組成，并在兩端分別加入AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位點，設計出的特異性針對Bak1的序列及無關對照序列（scr）如下：

Bak1PrimerF1：Bak1PrimerR1：Bak1PrimerF2：Bak1PrimerR2：Bak1PrimerF3：Bak1PrimerR3：scrPrimerF1：scrPrimerR1：CCGGCCTGTTTGAGAGTGGCATCAACTCGAGTTG ATGCCACTCTCAAACAGGTTTTTG AATTCAAAAACCTGTTTGAGAGTGGCATCAACTC GAGTTGATGCCACTCTCAAACAGG CCGGCCGACGCTATGACTCAGAGTTCTCGAGAA CCTCTGAGTCATAGCGTCGGTTTTTG AATTCAAAAACCGACGCTATGACTCAGAGTTCT CGAGAACTCTGAGTCATAGCGTCGG CCGGTGGTACGAAGATTCTTCAAATCTCGAGATT TGAAGAATCTTCGTACCATTTTTG AATTCAAAAATGGTACGAAGATTCTTCAAATCTC GAGATTTGAAGAATCTTCGTACCA CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCG AGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTG AATTCAAAAACCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCT CGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG

將合成的寡聚核苷酸鏈分別重懸于ddH2O至濃度為100pmol/L，加入到RNase free PCR管中，再 依 次 加 入 Forward Primer 1μl、Reverse Primer 1μl、10×退火 Buffer 3μl， 最后補加 ddH2O 至總體積50μl，輕輕混勻后按如下條件進行退火反應：94℃ 預 變 性 5min，94℃ 變 性 30s，70℃ 退 火 30s，50℃延伸2min，4℃冷卻，使上、下游引物互補配對形成雙鏈。⑵pAd-GFP-shBak1重組質粒的構建：利用AgeⅠ、EcoRⅠ酶切pAd-GFP-shRNA質粒，酶切反應體系如下：pAd-GFP-shRNA質粒 2μg，Age Ⅰ 、EcoR Ⅰ 各 1μl，10 ×NEB Buffer 2μl， 加ddH2O至20μl。37℃，酶反應4h后，電泳并膠回收線性化的pAd-GFP-shRNA質粒。在T4 DNA連接酶作用下分別進行退火后的shRNA、scr與線性化的pAd-GFP-shRNA的連接，連接體系為：退火后的shRNA或scr 2μl，線性化的pAd-GFP-shRNA 1μl，T4 DNA ligase 1μl，10 ×NEB T4 DNA ligase Buffer 2μl，加 ddH2O 至 20μl。 16℃孵育過夜，將連接產(chǎn)物分別轉化感受態(tài)的DH5α細胞。挑選抗性克隆用質粒小提試劑盒提取重組質粒，并對其分別進行測序鑒定。將鑒定正確的重組質粒命名為shRNA-1、shRNA-2、shRAN-3、scr。 ⑶pAd-shBak1腺病毒載體沉默效率篩選：對測序正確的重組質粒進行克隆，擴大培養(yǎng)后提取無內毒素質粒，用Lipofectamine 2000脂質體轉染MG63細胞。轉染前1d，在500μl無抗生素培養(yǎng)基中接種2×105個細胞，待細胞達到90%-95%匯合時分別轉染重組質粒。48h后消化收集細胞，利用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，采用ABI7500型定量PCR儀進行定量PCR反應，以2-△△CT法分析基因的相對表達量。反應體系為：2×qPCR Mix 12.5μl，7.5μM 基因引物 2.0μl，cDNA 2.5μl，ddH2O 8.0μl。PCR反應條件為：95℃預變性2min，95℃變性10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s（45 個循環(huán)）。 引物序列見表1。提取細胞總蛋白，采用Bradford法測定蛋白質濃度，然后進行SDS-PAGE電泳、轉膜，用5%脫脂牛奶封閉1h，一抗 （TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA）4℃孵育過夜，二抗（TBST稀釋3000倍）室溫孵育30min，ECL化學發(fā)光顯色，X線片顯影、定影，將膠片進行掃描存檔，Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值，篩選最優(yōu)沉默效果的克隆。⑷腺病毒包裝與擴增及滴度測定：將篩選出的具有最優(yōu)沉默效果的重組腺病毒載體及scr進行擴大培養(yǎng)，提取質粒。重組腺病毒質粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用Lipofectamine 2000脂質體轉染融合度為95%的HEK 293A細胞包裝病毒，在轉染后5-6d細胞可出現(xiàn)顯微鏡可見的細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE），繼續(xù)培養(yǎng)到80%細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，收集被感染的細胞和上清，反復凍融（-80℃/37℃）裂解細胞4次，收集病毒懸液，制備第一代的病毒懸液，用第一代原病毒懸液感染HEK 293A細胞，按上述方法擴增病毒，收集高滴度的病毒懸液，通過熒光顯微鏡觀察腺病毒的GFP表達情況，熒光顯微鏡下計數(shù)每視野熒光細胞數(shù)，按下列公式計算病毒滴度：病毒滴度（GFU/ml）=熒光細胞數(shù)量×出現(xiàn)熒光標記細胞最低病毒稀釋度×100。

1.2.2 MG63細胞增殖的MTT檢測 收集對數(shù)生長期的MG63細胞，胰蛋白酶消化處理后制成單細胞懸液，將細胞懸液（細胞數(shù)約1×104/ml）接種于96孔板中培養(yǎng)24h，實驗設置空白對照組 （NC對照組）及實驗組，實驗組予重組腺病毒感染 （MOI=50），48h 后每孔加入 10μl MTT 溶液 （5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入200μl DMSO，置于搖床上室溫低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，在酶標儀OD 490nm處測量各孔的吸光值并繪制細胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較采用成組比較的t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

表1 腺病毒載體的qPCR引物序列

2 結果

2.1 腺病毒載體質粒的構建

2.1.1 腺病毒載體質粒的測序 測序結果顯示，Bak1的shRNA序列及無關對照序列均已成功連接到pAd-GFP-shRNA載體上。

2.1.2 腺病毒載體沉默效率的篩選 腺病毒載體質粒在Lipofectamine 2000脂質體上轉染MG63細胞，qPCR及western blot檢測重組質粒對Bak1表達的影響，結果提示所設計的第2條及第3條shRNA均可下調Bak1蛋白的表達，第3條shRNA序列下調效果最明顯（P<0.05）。見圖1，圖2。

圖1 腺病毒載體對MG63細胞Bak1表達量的影響（*與空白對照相比，P＜0.05）

圖2 腺病毒載體對MG63細胞Bak1蛋白表達的影響（*與空白對照相比，P＜0.05）

2.2 重組腺病毒滴度的測定 對下調效果最明顯的第3條shRNA序列進行腺病毒的包裝擴增，測定病毒滴度，熒光顯微鏡下計數(shù)每視野熒光細胞數(shù)，計算 shRNA-3 病毒滴度為 7.7×108GFU/ml，scr病毒滴度為6.3×108GFU/ml。見表2。

表2 腺病毒滴度測定結果

2.3 shRNA-3重組腺病毒對MG63細胞活性的影響 通過MTT法檢測細胞活性，結果顯示與空白對照組相比，下調Bak1的表達可以增強MG63細胞的活性（P<0.05），見圖 3。

圖3 重組腺病毒對MG63細胞活性影響（*與空白對照相比，P＜0.05）

3 討論

骨質疏松癥是一種衰老性疾病，隨著年齡增長，骨代謝失衡，出現(xiàn)骨量丟失和骨強度下降，骨微結構破壞，導致疼痛和骨折，同時受多種因素影響[8]，發(fā)病率日益增高[9]。成骨細胞具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質中的多種有機成分，對骨生長有重要作用。Bak1基因1995年Farrow、Chittenden與Kiefer各自獨立克隆的Bcl-2基因家族的成員，定位于6p21.3-p21.2，包括3個外顯子，全長6kb，具有高度的保守性[10-12]。Bak1蛋白定位于線粒體外膜上的促進凋亡蛋白，在凋亡剌激誘導下，Bax/Bak可以發(fā)生寡聚化，在線粒體外膜上形成孔道，導致細胞色素C等促調亡蛋白從線粒體中釋放，導致細胞調亡[13]。Bcl2蛋白家族之間的相互作用對細胞凋亡的調控起著重要作用，因此越來越多的研究關注其具體分子機制及在不同疾病模型中的作用，為開展疾病的治療提供思路[14-17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)與非骨質疏松者相比，骨質疏松癥患者骨骼肌線粒體通透轉換孔活性、松質骨Bak1的表達明顯升高[7，18]，意味著更多促凋亡物質的刺激或通過，更快的誘導細胞的凋亡。因此，研究Bak1在成骨細胞骨形成中的作用，增強成骨細胞活性延緩成骨細胞的凋亡，就顯得非常必要。

基因功能研究的一個重要手段就是RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，又稱為轉錄后基因沉默[19]。特異性小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）導入細胞可使目的基因不表達或降低其表達，但其作用時間較短暫，不適于研究干擾靶基因后細胞活性及關鍵蛋白表達的變化[20]。shRNA是根據(jù)siRNA的序列設計合成的包括2個短的反方向的重復序列、中間由一莖環(huán)結構連接的結構，其穩(wěn)定性更高，作用更持久，在隨表達載體進入體內時，可以由Dicer酶切割，再參與對目的基因的特異性沉默。但是不論shRNA還是siRNA，直接轉染細胞的效率均比較低，需要借助中間載體。腺病毒是目前用于基因轉移最廣泛的載體之一，具有感染譜廣、低致病性、高滴度、大容量以及在體內不整合入宿主細胞染色體等優(yōu)點[21]，而且腺病毒系統(tǒng)相對于慢病毒更容易操作、安全性更高。

RNAi技術應用的另一關鍵在于特異性序列的篩選，本研究設計了3條shRNA序列及一條無關序列（scr），構建穿梭質粒后首先轉染MG63細胞，通過qPCR及Western blot檢測Bak1 mRNA和蛋白水平變化，與空白對照組及scr組相比，剩余三組Bak1的表達均下調，以shRNA-3組的下調效果最明顯。之后再進行腺病毒的包裝與擴增，大大節(jié)省了時間及成本。經(jīng)反復擴增純化后，通過綠色熒光蛋白標記法測定病毒滴度為：7.7×108GFU/ml。重組腺病毒轉染MG63細胞，通過MTT檢測細胞活性，與空白對照組相比，shRAN-3組細胞活性明顯增強，說明下調Bak1的表達可增強成骨細胞活性，證明了其促凋亡作用。

綜上所述，本實驗設計了三條特異性針對Bak1的shRNA序列及無關序列，篩選出了干擾效果最明顯的序列，成功構建了重組腺病毒載體。通過轉染MG63細胞，證明了干擾Bak1可以增強成骨細胞活性，這為進一步研究Bak1在骨質疏松骨形成中的作用奠定了基礎。

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